枸杞子藥材中12種有機酸類成分含量測定與分析Δ

李佳興，周 利，金 艷，余 意，馬方勵，楊 健，郭蘭萍，2#

[1.中國中醫科學院中藥資源中心/道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006；3.無限極（中國）有限公司，廣州 510663]

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、益精明目的功效，主要用于虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽痿遺精、內熱消渴、血虛痿黃、目昏不明等癥的治療[1-2]。研究結果顯示，枸杞子含有多糖、有機酸、黃酮、氨基酸、維生素和微量元素等[3-4]，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤和調節免疫力等作用[5-8]。

有機酸類成分是中藥中酸味的主要來源，中醫五味講“酸入肝”“酸收斂”，相關研究發現有機酸類成分具有抗炎、抗血栓、抑制血小板凝聚等多種藥理活性[9-11]。據文獻報道，枸杞子中含有草酸、酒石酸等多種有機酸[12]，但目前其相關含量測定研究較少見。本研究采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法對不同產地的枸杞子藥材中水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、對香豆酸、富馬酸、3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原兒茶酸等12種有機酸類成分的含量進行了測定，并進行了成分含量差異分析，以期為枸杞子的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX 6500型質譜儀（美國Applied Biosystems公司）；Acquity UPLC I-Class系統，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerTM色譜工作站（美國Waters公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MM型400混合球磨儀（德國Retsch公司）；DHG-9145AZ型電熱干燥箱（上海恒科儀器有限公司）；New Classic MS-S型電子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；5810R型高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試劑

咖啡酸對照品（批號：K003161216，純度：≥98%）、對香豆酸對照品（批號：RD794160825，純度：≥98%）、富馬酸對照品（批號：F016170426，純度：≥98%）、3，4-二羥基苯甲酸對照品（批號：RY568160920，純度：≥98%）、酒石酸對照品（批號：J065161216，純度：≥98%）均購自北京融誠鑫德科技發展有限公司；香草酸對照品（批號：S27M7115319，純度：≥98%）、對羥基苯甲酸對照品（批號：MKBK3576V，純度：≥98%）、阿魏酸對照品（批號：16051311，純度：≥98%）、丁香酸對照品（批號：S23F7K9842，純度：≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；原兒茶酸對照品（上海同田生物技術股份有限公司，批號：15050521，純度：≥98%）；水楊酸對照品（批號：PS1136-0025，純度：≥98%）、肉桂酸對照品（批號：PS0094-0100，純度：≥98%）均購自成都普思生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

枸杞子藥材采自寧夏、青海、甘肅、新疆等枸杞子主產區，共15批（見表1），經中國中醫科學院中藥資源中心金艷副研究員鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B→25%B；1～3.5 min，25%B→40%B；3.5～4.5 min，40%B→50%B）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1.0 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源：Turbo VTM離子源；電離模式：電噴霧離子化（ESI－）；氣簾氣體積流量：30 L/min；噴霧電壓：－4 500 V；霧化氣體積流量：50 L/min；加熱輔助氣體積流量：50 L/min；掃描方式：質譜多反應監測（MRM）；離子化溫度：550℃。優化的條件參數見表2，提取離子流圖見圖1。

表1 枸杞子藥材來源Tab 1 Sources of L.barbarum

表2 優化的條件參數Tab 2 Optimized conditional parameters

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraction ion flow graph

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取各待測成分對照品適量，用甲醇制成質量濃度均為1 mg/mL的單一對照品貯備液。分別精密量取上述單一對照品貯備液各適量，用甲醇分組制成含水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、對香豆酸、富馬酸質量濃度均為20 μg/mL的混合對照品溶液和含3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸、原兒茶酸質量濃度均為20 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品細粉（過4號篩）50 mg，置于2 mL離心管中，精密加入甲醇1.5 mL，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，放冷至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，12 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下單一對照品貯備液各適量，用甲醇稀釋制成系列單一對照品溶液。精密量取上述系列單一對照品溶液各1.0 μL，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號強度。以各待測成分的質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、離子信號強度（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表3。

表3 回歸方程、線性范圍、定量限、檢測限考察結果Tab 3 Results of regression equations，linear ranges，limit of quantity and limit of detection

2.4 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液各適量，用甲醇倍比稀釋，并按“2.1”項下試驗條件進樣測定，分別以信噪比10∶1、3∶1計算定量限、檢測限，結果見表3。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件連續進樣測定6次，記錄離子信號強度。結果，水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、對香豆酸、富馬酸、3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原兒茶酸離子信號強度的RSD分別為0.48%、0.74%、0.78%、0.96%、0.88%、0.61%、0.52%、0.64%、0.56%、0.95%、0.96%、0.60%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：11）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號強度。結果，水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、對香豆酸、富馬酸、3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原兒茶酸離子信號強度的RSD分別為1.42%、0.81%、2.00%、1.43%、2.42%、1.36%、1.06%、1.97%、1.58%、1.68%、1.19%、2.31%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取藥材樣品（編號：11）細粉適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號強度并計算含量，結果見表4。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的藥材樣品（編號：11）細粉適量，每份0.1 g，共6份，分別加入一定質量濃度的單一對照品溶液各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子信號強度并計算加樣回收率，結果見表5。

表4 重復性試驗結果（n＝6）Tab 4Results of reproducibility tests（n＝6）

表5 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 5Results of recovery tests（n＝6）

續表5Continued tab 5

2.9 樣品中有機酸類成分含量測定及分析

取各批藥材樣品適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，平行測定3次，記錄離子信號強度并計算藥材樣品中有機酸類成分含量，然后進行成分含量差異分析和相關性分析，結果見表6～表9。由表6可知，15批藥材樣品中總有機酸平均含量為147.74 μg/g，其中以對香豆酸平均含量最高，達76.35 μg/g；阿魏酸、酒石酸和富馬酸平均含量分別為19.25、16.50、15.74 μg/g；對羥基苯甲酸和肉桂酸平均含量較低，分別為8.13、4.90 μg/g；丁香酸平均含量最低，為0.17 μg/g。由表7可知，新疆產區所產藥材樣品中總有機酸平均含量最高，達209.21 μg/g；其次為青海產區樣品，含量達154.31 μg/g；甘肅和寧夏產區樣品含量較低。由表8可知，從品種看，寧杞七號總有機酸含量略高，達153.70 μg/g，其中對香豆酸平均含量為80.64 μg/g；寧杞五號總有機酸平均含量略低，為140.94 μg/g，其中對香豆酸平均含量為71.44 μg/g。由表9可知，香草酸含量與對羥基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸含量存在極顯著正相關（P＜0.01）；肉桂酸含量與富馬酸和酒石酸含量存在極顯著正相關（P＜0.01）；咖啡酸含量與阿魏酸、酒石酸和丁香酸含量存在極顯著正相關（P＜0.01）；對羥基苯甲酸含量與丁香酸含量存在極顯著正相關（P＜0.01）；阿魏酸含量與丁香酸含量存在極顯著正相關（P＜0.01）；3，4-二羥基苯甲酸含量與原兒茶酸含量存在極顯著正相關（P＜0.01）。

3 討論

本課題組采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法測定了枸杞子藥材樣品中12種有機酸類成分的含量，由試驗結果可知，不同批次的枸杞子藥材樣品中總有機酸和12種有機酸類成分含量差異較大。推測其原因除了品種這一遺傳因素外，不同產區的地理條件、土壤成分、氣候特征、光照強度等生態因子也極大地影響了相關有機酸成分的積累[13-14]。

枸杞子藥材樣品中各有機酸類成分含量之間相關性分析顯示，多種有機酸達到極顯著正相關。中藥的功效是多種成分共同作用的結果，與其不同成分的含量和比例相關，因此根據本研究結果中枸杞子藥材中各有機酸類成分含量的相關性有助于進一步分析該類成分與復雜藥效的關系。

表6 藥材樣品中有機酸類成分含量測定結果（n＝3，μg/g）Tab 6Content determination results of organic acids in samples（n＝3，μg/g）

表7 不同產區藥材樣品中有機酸類成分平均含量比較（μg/g）Tab 7Comparison of the average contents of organic acids in samples from different production areas（μg/g）

表8 不同品種藥材樣品中有機酸類成分平均含量比較（μg/g）Tab 8Comparison of the average contents of organic acids in samples with different types（μg/g）

表9 藥材樣品中各有機酸類成分含量之間的相關性Tab 9 Correlation of different organic acids in samples

綜上所述，該方法操作簡便、準確，精密度、穩定性、重復性好，可用于同時測定枸杞子藥材中12種有機酸類成分含量。不同產區、品種藥材樣品中有機酸類成分含量有所不同，且某些成分間有一定的相關性。