牡丹皮藥材的HPLC指紋圖譜建立和聚類分析Δ

侯錫鴻，葛梅，張迎春，曾忠良

（西南大學藥學院，重慶 400715）

牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的干燥根皮[1]，其主要活性成分為以丹皮酚為主的酚酸類和以芍藥苷為主的苷類[2]。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的功效，現代藥理學研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等作用[3]，含有該藥材的六味地黃丸是其臨床應用的典范。

牡丹皮以重慶墊江產（習稱“川丹”）、安徽銅陵和鳳陽產（習稱“鳳丹”）的質量較優[4]，但因其基源植物牡丹集觀賞性和藥用于一體，在近年大力發展觀光農業、大面積種植觀賞牡丹的情況下，市售牡丹皮藥材的產地及來源極其復雜、質量良莠不齊，其藥用效果和臨床用藥安全也受到極大影響。2015年版《中國藥典》（一部）牡丹皮的質量控制指標項下也僅有丹皮酚含量測定，顯然難以全面反映該藥材真實的內在質量。

指紋圖譜技術能較全面地反映中藥的特征化學信息，在樣品真偽鑒別評價等方面表現出較大的優勢[5]，且該技術與中醫藥整體觀相符，目前已成為國際公認的中藥及天然藥物質量控制技術[6]。在目前牡丹皮基源植物育種背景不清楚、藥材質量控制及評價體系不完善的大環境下，已有的相關檢驗鑒別技術專屬性差等問題已顯露[7-10]。為此，筆者對重慶墊江、安徽銅陵和亳州等地采集以及市售的共69批牡丹皮藥材樣品進行高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，以期為該藥材的真偽鑒別和質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD型HPLC儀（包括DGU-20A3R脫氣機、LC-20AD溶液輸送單元、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution色譜工作站）、LCMS-8030型HPLC-質譜（MS）儀、AUW220D型十萬分之一電子分析天平均購自日本Shimadzu公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義市予華儀器有限責任公司）；CS-700型高速多功能粉碎機（永康市天祺盛世工貿有限公司）。

1.2 試劑

丹皮酚對照品（批號：150722，純度：＞98%）、芍藥苷對照品（批號：150819，純度：＞98%）、沒食子酸對照品（批號：150729，純度：＞98%）、沒食子酸甲酯對照品（批號：150903，純度：＞98%）均購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；氧化芍藥苷對照品（批號：YY90574-201703，純度：＞98%）、苯甲酰氧化芍藥苷對照品（批號：BWB51073-201704，純度：＞98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丹皮酚原苷對照品（成都普思生物科技有限公司，批號：D-019-150925，純度：＞99%）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

69批牡丹皮藥材樣品由筆者自采或購買（來源見表1），經西南大學藥學院陳前鋒副教授鑒定為真品。

表1 牡丹皮藥材來源Tab 1 Sources of P.suffruticosa

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Ecosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式檢測；掃描范圍：m/z100～1 200；干燥氣：N2（純度：99.999 9%）；干燥氣流速：15 L/min；干燥氣溫度：350℃；碰撞低能量：4 V；碰撞高能量：10～40 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取丹皮酚、芍藥苷、沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、苯甲酰氧化芍藥苷對照品各適量，加甲醇分別制成單一對照品貯備液；分別精密量取上述單一對照品貯備液各0.8 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容搖勻，制成每1 mL含0.266 mg丹皮酚、0.798 mg芍藥苷、0.884 mg沒食子酸、1.393 mg氧化芍藥苷、0.143 mg沒食子酸甲酯、0.096 mg丹皮酚原苷、0.090 mg苯甲酰氧化芍藥苷的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品適量，粉碎后過80目篩；取粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，精密加70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率：700 W，頻率：40 kHz）提取30 min；取出，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻；經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S19）適量，按“2.1”項下試驗條件連續進樣測定6次，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.37%（n＝6），相對峰面積的RSD為0.54%～3.53%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S19）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.32%（n＝6），相對峰面積的RSD為0.47%～4.65%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S19）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間的RSD為0～0.62%（n＝6），相對峰面積的RSD為1.47%～4.97%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC-MS指紋圖譜分析

2.4.1 HPLC-MS指紋圖譜的生成 取69批藥材樣品粉末各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A）》對69批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 69批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprint of 69 batches of samples

圖2 藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC reference fingerprint of samples

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A）》，以生成的HPLC對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，69批藥材樣品中，除6批的相似度小于0.900外，其余63批的相似度均大于0.900，表明大部分藥材樣品間差異較小、質量穩定性較好，詳見表3。

表3 69批藥材樣品相似度評價結果Tab 3 Similarity evaluation of 69 batches of samples

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 根據MS離子峰及碎片信息與保留時間，綜合對照品MS信息及文獻報道的MS數據[11-14]對藥材樣品的指紋圖譜中的共有峰進行結構歸屬的初步判斷。通過與混合對照品MS圖譜的離子峰信息進行比對，確定峰4、8、9、11、14、24、25分別是沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、芍藥苷、苯甲酰氧化芍藥苷、丹皮酚；推測鑒定出了29個共有峰，詳見表4。

2.5 聚類分析

以各共有峰相對峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件，以歐氏距離分層聚類法中的Ward法對69批藥材樣品進行系統聚類分析，詳見圖3。由圖3可知，取歐氏距離為10時，69批藥材樣品可聚為5類：S4～S6為重慶墊江太平鎮生長年限在17年及以上的藥材樣品，與其他藥材樣品有顯著差異，相似度均小于0.800，和S41聚為第Ⅱ類；采自重慶墊江太平鎮的S1～S3栽培品和采自安徽的S7～S9栽培品除S3外其他相似度均大于0.900，同S10、S12、S24、S25、S54、S59聚為第Ⅲ類；市售藥材樣品主要聚為第Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ類。

3 討論

在預試驗中，筆者比較了不同體積分數的甲醇（60%、70%、80%、90%）作為提取溶劑時的提取效率。結果，采用70%甲醇作為提取溶劑時，色譜峰數量較多，峰面積響應好，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。因丹皮酚為易揮發性物質，故提取方法選擇超聲提取。筆者考察了不同超聲提取時間（15、30、45、60 min）對提取效率的影響，結果30 min的提取效率優于15 min，而再延長提取時間后提取效率無明顯差別，因此選擇30 min作為提取時間。

表4 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜中各共有峰對應成分的推測鑒定結果Tab 4 Speculativeness and identification of corresponding components of the peaks in HPLC reference fingerprint of samples

圖3 聚類分析樹狀圖Fig 3 Hierarchical cluster dendritic diagram

本試驗通過對69批牡丹皮藥材樣品進行分析，并推測鑒定出29個共有峰的對應成分，主要是單萜苷類、酚酸類及黃酮類成分，這些共有成分可作為對牡丹皮藥材進行質量控制的重要指標。

69批藥材樣品中有3批（S1～S3）為重慶墊江產的2年生的自采樣品，3批（S4～S6）為重慶墊江產的17年以上的自采樣品，3批（S7～S9）為安徽產的4年生的自采樣品。相似度評價結果顯示，生長年限在17年及以上的藥材樣品（S4～S6）的相似度均小于0.900，而其余市售或自采樣品（除S21、S55外）相似度大部分均大于0.900，反映了生長年限在3～5年的藥材樣品質量更穩定。聚類分析中生長年限在17年及以上的藥材樣品（S4～S6）和S41聚為一類，顯示出與其他藥材樣品有明顯差異。重慶墊江另外3個自采樣品（S1～S3）和安徽的自采樣品（S7～S9）能聚為一類，顯示兩個產地品種質量的相似性。而市售其他藥材樣品主要聚為另外3類，且相似度大多大于0.900，提示市售藥材樣品化學成分整體上較為穩定，但也會受到產地、生長年限、加工方式、貯藏條件和時間等多種因素影響而產生一定波動[15-20]。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜、成分鑒定和聚類分析結果可為牡丹皮藥材的真偽鑒別和質量評價提供依據。