新型胰島素增敏劑ZG02在大鼠肝微粒體中的代謝穩定性研究Δ

陳瑞，張麗，蔡進，朱高峰1，，湯磊1，，黃靜#

（1.貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心，貴陽 550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴陽 550004）

胰島素增敏劑是一類針對胰島素抵抗的2型糖尿病的治療藥物，也是目前降糖藥研發的熱點之一[1]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一種重要的代謝應激蛋白激酶，在調節代謝和能量平衡特別是在胰島素抵抗發生過程中發揮著重要的作用[2-3]。本課題組在前期研究中發現一系列四氫咔唑類化合物具有明顯的降糖作用，其中的代表性化合物ZG02[6-芐氧基-9-（4-氯甲苯?；?四氫化咔唑-3-羧酸，化學結構見圖1]具有較好的胰島素增敏活性，可通過激活AMPK途徑來降低db/db小鼠的血糖和胰島素水平[4]；同時，ZG02在體內活性測試中并未表現出羅格列酮樣體質量增加等不良反應[5]，是一種極具開發價值和應用前景的化合物。

圖1 ZG02的化學結構Fig 1 Chemical structure of ZG02

與體內代謝研究不同，體外代謝研究可在新藥研發早期利用體外代謝參數合理預測候選化合物的體內藥動學行為，指導其后期藥效學、藥動學研究以及安全性評價模型的選擇，有助于縮小體內研究的篩選范圍[6-7]?；衔锎x穩定性差意味著其在體內較易被代謝，往往導致不良的藥動學性質，如體內生物利用度低、作用時間短等[8]。藥物代謝可分為Ⅰ相和Ⅱ相：Ⅰ相代謝最重要的酶系為細胞色素P450（CYP），該酶系包含兩個重要的蛋白組分，即含鐵血紅素蛋白和黃素蛋白，后者能將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（即還原型輔酶Ⅱ，NADPH）的電子轉移至CYP-底物復合體上，完成藥物的氧化、還原反應[9-11]；Ⅱ相代謝的結合代謝酶為尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸轉移酶（UGT），其中UGT是一類位于內質網膜上的超家族代謝酶，也是Ⅱ相代謝過程中的主要酶系，可以將尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）上的葡萄糖醛酸轉移至內源性或外源性化合物上，完成藥物的葡萄糖醛酸化結合反應[12-13]。為初步預測ZG02在大鼠體內的代謝情況，本研究以超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）為檢測手段，對ZG02在大鼠肝微粒體孵育體系（包括Ⅰ相、Ⅱ相及兩相孵育體系）中的體外代謝特征進行分析，以期為其體內消除規律研究、代謝產物確證以及藥物應用等提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS型超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜儀（UPLC-QTOF-MS），配有MassLynx V4.1質譜工作站、UNIFI 7.0數據庫（美國Waters公司）；JN300-2型氮氣吹掃儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）；X1型高速離心機（香港基因有限公司）；KH-600E型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；FA805N型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）；DW-86L486型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

ZG02對照品[貴州醫科大學藥物化學重點實驗室制備，純度：＞98%]；吲哚美辛對照品（內標，批號：J0526A5，純度：＞98%）、雄性SD大鼠肝微粒體（批號：J0202A）均購自大連美侖生物技術有限公司；葡萄糖-6-磷酸二鈉（G-6-P-Na2，批號：116B039）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-P-DH，批號：20160725）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（NADP-Na2，批號：718B0225）均購自北京索萊寶科技有限公司；UDPGA（美國Sigma-Aldrich公司，批號：SLBT1945）；1，4-單內酯（上海源葉生物科技有限公司，批號：S10M8I31074）；丙甲菌素（加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號：8-JIN-165-1；臨用前用適量二甲基亞砜溶解，再用水稀釋至相應濃度）；甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純，氯化鎂、檸檬酸鈉等均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 待測物和內標溶液 精密稱取ZG02對照品適量，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為20 mg/L的ZG02貯備液；同法配制質量濃度為10 mg/L的內標貯備液；上述溶液均置于4℃冰箱中保存，備用。臨用前，將ZG02貯備液用適量甲醇稀釋后，再以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，下同）稀釋至孵育濃度，并確保孵育體系中甲醇的含量不超過1%[14]；將內標貯備液用甲醇稀釋，得質量濃度為100 μg/L的內標溶液。

2.1.2 NADPH輔酶溶液 A液：依次取NADP-Na2200 mg、G-6-P-Na2200 mg、氯化鎂133 mg，用水溶解并定容至10 mL，于－20℃保存。B液：依次取檸檬酸鈉44 mg、G-6-P-DH 1 000 U，用水溶解并定容至25 mL，于－20℃保存。臨用前，取A、B液按體積比5∶1混勻，得濃度為1 mmol/L（按反應產物NADPH計）的NADPH輔酶溶液[15]。

2.1.3 UDPGA輔酶溶液 精密稱取UDPGA適量，臨用前用水溶解并定容，配制成濃度為5 mmol/L的UDPGA輔酶溶液。

2.2 體外孵育體系的建立

2.2.1 由NADPH啟動的Ⅰ相孵育體系 取大鼠肝微粒體適量，用PBS稀釋至0.5 g/L，隨后加入“2.1.1”項下經稀釋的ZG02貯備液適量，使ZG02的最終質量濃度為100 μg/L。將上述溶液置于37℃水浴中靜置5 min后，加入“2.1.2”項下NADPH輔酶溶液30 μL以啟動反應。該體系總體積為200 μL，有機溶劑的含量不得超過5%。

2.2.2 由UDPGA啟動的Ⅱ相孵育體系 取大鼠肝微粒體適量，用PBS稀釋至0.5 g/L，加入丙甲菌素[0.025 g/L（最終質量濃度，下同）]，混勻，于冰浴中孵育15 min；隨后加入1，4-單內酯（5 mmol/L）、氯化鎂（5 mmol/L）以及“2.1.1”項下經稀釋的ZG02貯備液適量，使ZG02的最終質量濃度為100 μg/L。將上述溶液置于37℃水浴中靜置5 min后，加入“2.1.3”項下UDPGA輔酶溶液30 μL以啟動反應。該體系總體積為200 μL，有機溶劑的含量不得超過5%。

2.2.3 由NADPH和UDPGA聯合啟動的兩相孵育體系 取大鼠肝微粒體適量，用PBS稀釋至0.5 g/L，加入丙甲菌素（0.025 g/L），混勻，于冰浴中孵育15 min；隨后加入1，4-單內酯（5 mmol/L）、氯化鎂（5 mmol/L）以及“2.1.1”項下經稀釋的ZG02貯備液適量，使ZG02的最終質量濃度為100 μg/L。將上述溶液置于37℃水浴中靜置5 min后，加入“2.1.2”項下NADPH輔酶溶液和“2.1.3”項下UDPGA輔酶溶液30 μL以啟動反應。該體系總體積為200 μL，有機溶劑的含量不得超過5%。

2.2.4 大鼠肝微粒體孵育及樣品處理 取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項下經啟動的孵育體系各適量，置于37 ℃水浴中，分別于孵育0、5、10、15、20、30、45 min時加入含內標100 μg/L的乙腈溶液400 μL終止反應，渦旋混勻30 s后，于4℃下以16 000×g離心10 min；取上清液以氮氣流吹干，殘渣用甲醇復溶，以16 000×g離心10 min；取上清液適量進行UPLC-MS/MS分析，考察各時間點孵育體系中ZG02的質量濃度。各孵育體系均平行操作3次。

2.3 UPLC-MS/MS方法學考察

2.3.1 色譜與質譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；保護柱：Waters VanGuard BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）（35∶65，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；采集時間：3 min。離子源：電噴霧離子源（ESI）；以多反應監測（MRM）模式進行負離子掃描；毛細管電壓：1.5 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：300℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：600 L/h；掃描范圍：m/z50～1 000；二級碰撞能量：16.5 eV；用于定量分析的離子對分別為m/z458.115 9→323.073 0（ZG02）、m/z356.069 0→312.080 4（內標）。ZG02和內標的二級質譜圖見圖2。

2.3.2 專屬性 取空白孵育樣品（即“2.2.3”項下不含ZG02的兩相孵育體系）、ZG02對照樣品（即“2.2.3”項下含ZG02的兩相孵育體系）、肝微粒體孵育樣品[即“2.2.3”項下含ZG02兩相孵育體系按“2.2.4”項下方法處理后（孵育30 min時）所得樣品]各適量，按“2.3.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，色譜圖見圖3。結果，內標和ZG02的峰形均良好，保留時間分別為0.70、1.57 min，孵育體系中的內源性物質并未干擾待測物的測定，提示本方法的專屬性良好。

圖2 ZG02和內標的二級質譜圖Fig 2 Secondary mass spectrums of ZG02 and internal standard

圖3 典型MRM圖Fig 3 Typical MRM chromatograms

2.3.3 標準曲線的繪制、定量下限及最低檢測限的考察 取“2.1.1”項下ZG02貯備液適量，分別用PBS稀釋成質量濃度為10、20、50、200、500、1 000、2 000、4 000 μg/L的系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各適量，加至“2.2.3”項下經甲醇滅活的大鼠肝微粒體兩相孵育體系（200 μL）中，配制成ZG02質量濃度分別為1、2、5、20、50、100、200、400 μg/L的系列樣品溶液，按“2.2.4”項下方法孵育2 h后，再按“2.3.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標、待測物質量濃度（c，μg/L）為橫坐標，采用加權最小二乘法（權重系數為1/c2）進行線性回歸。另同法配制并處理得質量濃度分別為1、0.5、0.25 μg/L的樣品溶液，考察定量下限（信噪比為10∶1）和最低檢測限（信噪比為3∶1）。結果，回歸方程為y＝0.097 2c+0.002 7（r2＝0.999 2），ZG02檢測質量濃度線性范圍為1～400 μg/L，定量下限為1 μg/L，最低檢測限為0.25 μg/L。

2.3.4 精密度與準確度試驗 按“2.3.3”項下方法配制ZG02低、中、高質量濃度（2、100、200 μg/L）的質控樣品各5份，按“2.2.4”項下方法孵育2 h后，進樣分析，考察日內精密度；連續測定3 d，考察日間精密度。將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察準確度。結果，各質控樣品的日內、日間RSD均小于10%，準確度為87.26%～94.58%，詳見表1。

表1 精密度、準確度及穩定性試驗結果Tab 1 Results of accuracy，precision and stability tests

2.3.5 提取回收率及基質效應考察 按“2.3.3”項下方法配制ZG02低、中、高質量濃度（2、100、200 μg/L）的質控樣品各5份，按“2.2.4”項下方法孵育2 h后，進樣分析，得色譜峰峰面積（A1）。取“2.2.3”項下兩相孵育體系適量，按“2.2.4”項下方法孵育2 h后，加入ZG02對照品溶液適量，使最終質量濃度與質控樣品對應，進樣分析，得色譜峰峰面積（A2）。以甲醇配制對應質量濃度的ZG02樣品，按“2.2.4”項下方法孵育2 h后，進樣分析，得色譜峰峰面積（A3）。每個質量濃度平行操作5次。提取回收率＝A1/A2×100%，基質效應＝A2/A3×100%。結果，低、中、高質量濃度質控樣品和內標的提取回收率分別為（82.86±3.23）%、（88.87±4.79）%、（81.13±8.28）%、（87.28±6.29）%，RSD分別為4.01%、5.39%、10.21%、7.16%（n＝5）；基質效應分別為（84.22±3.58）%、（88.72±5.22）%、（93.56±4.28）%、（93.81±5.06）%，RSD分別為4.25%、5.88%、4.57%、5.39%（n＝5），表明提取方法和基質效應均不會影響ZG02質量濃度的測定。

2.3.6 穩定性試驗 按“2.3.3”項下方法配制ZG02低、中、高質量濃度（2、100、200 μg/L）的質控樣品各5份，按“2.2.4”項下孵育2 h后，考察其在室溫下放置12 h的穩定性（以實測質量濃度與理論質量濃度的比值即回收率表示）。結果，各質控樣品回收率的RSD均小于10%（n＝5），表明其在室溫下放置12 h穩定，詳見表1。

2.4 ZG02體外代謝穩定性研究

按“2.2.4”項下方法進行體外代謝穩定性研究，采用底物消除法考察ZG02的代謝情況。以孵育0 min時ZG02的質量濃度為參照，其他時間點的質量濃度與之相比計算其藥物剩余百分比，采用GraphPad Prism 7.0軟件繪制ZG02在3種孵育體系中的藥物剩余百分比-時間曲線，詳見圖4。由圖4可見，ZG02在Ⅰ相孵育體系中代謝較慢，而在兩相孵育體系中代謝較快。

將各時間點的藥物剩余百分比的自然對數對孵育時間作線性回歸，得斜率k，并以此計算ZG02的酶動力學參數[包括半衰期（t1/2）和清除率（CLint）]和各代謝酶的貢獻率（F）。其中，t1/2＝－0.693/k，CLint＝[（0.693/t1/2）×孵育體系體積（μL）]/肝微粒體質量（mg）[14]；FⅠ相＝CLint（Ⅰ相）/CLint（兩相）×100%，FⅡ相＝CLint（Ⅱ相）/CLint（兩相）×100%。以t1/2評估代謝穩定性：t1/2＜30 min，為代謝不穩定；30 min≤t1/2≤90 min，為代謝穩定性中等；t1/2＞90 min，為代謝穩定[15]，結果詳見表2。

圖4 ZG02在大鼠肝微粒體不同孵育體系中的藥物剩余百分比-時間曲線Fig 4 Residual percentage-time curves of ZG02 in liver microsomes of rats in different incubation systems

表2 ZG02在大鼠肝微粒體不同孵育體系中的酶動力學參數Tab 2 Enzyme kinetic parameters of ZG02 in liver microsomes of rats in different incubation systems

由表2可見，孵育45 min時，在NADPH啟動的Ⅰ相孵育體系和UDPGA啟動的Ⅱ相孵育體系中，ZG02的剩余百分比分別為（73.33±1.53）%、（50.63±3.42）%，t1/2分別為67.28、30.26 min，表明其在單相孵育體系中的代謝穩定性中等，且在Ⅱ相中的代謝穩定性較Ⅰ相差；在NADPH和UDPGA聯合啟動的兩相孵育體系中，ZG02的剩余百分比為（45.81±2.56）%，t1/2為25.57 min，提示其在兩相孵育體系中的代謝穩定性差。

另外，F值的分析結果顯示，CYP酶（Ⅰ相代謝酶）、UGT酶（Ⅱ相代謝酶）的F值分別為38.01%、84.50%，后者的F值更大，提示ZG02在大鼠肝微粒體中的代謝反應可能以UGT酶介導的葡萄糖醛酸化結合反應為主。

3 討論

與體內代謝穩定性研究相比，藥物體外代謝穩定性研究可排除體內諸多干擾因素（如磷脂、脂肪酸、尿素等）的影響，有助于更直接地觀察藥物的代謝特征，具有省時、穩定、高效的特點，適用于體內代謝轉化率低且缺乏高靈敏度檢測方法的藥物，亦可用于候選化合物的高通量篩選[6-7，14]。但現有藥物體外代謝穩定性研究多集中在CYP酶介導的Ⅰ相代謝上，而對UGT酶介導的Ⅱ相代謝相關研究較少[16]。為此，本研究分別以NADPH啟動的Ⅰ相孵育體系、UDPGA啟動的Ⅱ相孵育體系、二者共同啟動的兩相孵育體系為介質，借助UPLC-MS/MS法考察了新型胰島素增敏劑ZG02的體外代謝穩定性。

3.1 Ⅱ相孵育體系的建立

經正常離心后得到的微粒體有部分為微粒體小囊泡，UGT酶的活性位點被封閉在其中，因此需要將其與適量的丙甲菌素混合，并通過在冰浴中孵育（15 min）來為內質網膜“打孔”，以釋放肝微粒體中的UGT酶[14]。

3.2 UPLC-MS/MS法的條件篩選

本研究在前期預試驗中考察了水-甲醇、水-乙腈、水（含甲酸）-甲醇、水（含甲酸）-乙腈、水（含甲酸）-甲醇（含甲酸）、水（含甲酸）-乙腈（含甲酸）等流動相體系對ZG02定量分析的影響。結果顯示，當以水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）（35∶65，V/V）為流動相進行洗脫時，ZG02和內標的色譜峰峰形均良好，且不受內源性物質的干擾，同時分析時間較短，故最終選擇其作為定量分析的流動相體系。

3.3 孵育體系中藥物質量濃度的確定

底物消除法是一種常用的檢測藥物代謝酶動力學參數的方法[17]。由于本課題組暫未能確證ZG02的代謝產物，故采用底物消除法來評估該化合物的體外代謝情況。為了能夠排除系統誤差的干擾以準確檢測ZG02的代謝情況，本課題組在預試驗中對孵育體系中的藥物質量濃度（25、100、1 000 μg/L）進行了優化。結果發現，當ZG02的質量濃度為100 μg/L時，孵育后剩余藥物質量濃度并不算太高，且至少有20%的藥物被清除[15]，故以此作為孵育體系中ZG02的質量濃度。

3.4 ZG02在大鼠肝微粒體中的代謝特征分析

本研究結果顯示，在NADPH啟動的Ⅰ相孵育體系、UDPGA啟動的Ⅱ相孵育體系、二者共同啟動的兩相孵育體系中，ZG02 的t1/2分別為 67.28、30.26、25.57 min，CLint分別為20.60、45.80、54.20 μL/（mg·min）。這提示在3種孵育體系中，ZG02的代謝穩定性依次為Ⅰ相＞Ⅱ相＞兩相。CYP酶及UGT酶的F值分別為38.01%、84.50%。這提示ZG02在大鼠肝微粒體中的代謝反應可能以UGT酶介導的葡萄糖醛酸化結合反應為主。

綜上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS法簡便、快速、專屬性強，可用于大鼠肝微粒體孵育體系中ZG02質量濃度的測定及其體外代謝穩定性的研究。新型胰島素增敏劑ZG02在NADPH和UDPGA聯合啟動的兩相孵育體系中的代謝穩定性較差，且代謝反應可能以UGT酶介導的葡萄糖醛酸化結合反應為主。后續本課題組將借助高分辨質譜、波譜等手段確證ZG02的代謝產物，并結合體內外研究進一步闡明其代謝過程及特征，以期為其開發利用提供更多的參考。