Box-Behnken Design響應面法結合遺傳算法和直接搜索算法優化丹梔逍遙散的提取工藝Δ

蘇本正，江波，崔寧，于宗淵

（山東省中醫藥研究院，濟南 250014）

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，由白芍、當歸、茯苓、白術、柴胡、薄荷、炙甘草等多味藥材組合而成。明代薛己在此基礎上加入牡丹皮和梔子，制成加味逍遙散，又名丹梔逍遙散，具有養血健脾、疏肝清熱之功效，是調和肝脾的代表方劑[1]。

有研究表明，白芍中的芍藥苷對模型大鼠腦缺血后的血腦屏障具有保護作用[2]，對腫瘤細胞的生長有一定抑制作用[3]，對肝臟具有保護作用[4]；牡丹皮中的丹皮酚具有抗腫瘤[5]、抗神經系統氧化應激損傷[6]、抗動脈粥樣硬化[7]和改善血液循環[8]等作用；梔子中的梔子苷具有保肝利膽[9]、改善腦缺血[10]、調節血糖[11]和鎮痛抗炎[12]等作用。由此可見，梔子苷、芍藥苷和丹皮酚這3個成分與丹梔逍遙散養血健脾、疏肝清熱的攻效相呼應，均為該方重要的活性成分。此外有研究表明，該方中梔子苷、芍藥苷和丹皮酚含量均較高[13]。因此，本試驗選擇梔子苷、芍藥苷和丹皮酚為指標成分。

響應面法可通過建立連續變量曲面模型，對影響生物過程的因子及其交互作用進行評價，最終確定各因素的最優水平取值[14]。近年來，響應面法逐漸被用于中藥提取條件的優化中。美國MathWorks公司發布的MATLAB遺傳算法與直接搜索工具箱（GADS）是一系列函數的集合，可讓用戶在響應面法結果的基礎上同時使用遺傳算法[15-16]和直接搜索算法[17]來求解各種優化問題。

本試驗以乙醇體積分數、提取時間和液料比為考察因素，以丹梔逍遙散中梔子苷、芍藥苷和丹皮酚3個指標成分的綜合評分為評價指標，先采用Box-Behnken Design（BBD）響應面法進行試驗設計，建立數學模型并獲得目標函數后，再結合遺傳算法和直接搜索算法求解各因素的最優范圍與最優取值，為該方的提取工藝優化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀，包括2996二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站等（美國Waters公司）；TDL40B型低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；BP211D型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；FW-80型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）；KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 試劑

1.3 藥材

柴胡（批號：161201）、當歸（批號：160501）、白芍（批號：160601）、白術（批號：160401）、茯苓（批號：161001）、炙甘草（批號：160601）、牡丹皮（批號：160801）、梔子（批號：160701）和薄荷（批號：160901）藥材均購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經山東省中醫藥研究院林慧彬研究員鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 梔子苷、芍藥苷、丹皮酚的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Phenomenex Luna-C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm（0～30 min）、232 nm（30～65 min）、274 nm（65～90 min）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。在該色譜條件下，理論板數以梔子苷、芍藥苷、丹皮酚峰計均大于3 000，分離良好，分離度均大于1.5。色譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取指標成分對照品各適量，加甲醇制成梔子苷、芍藥苷和丹皮酚質量濃度分別為74.9、56.2、33.4 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取柴胡0.5 g、當歸0.5 g、白芍0.5 g、白術0.5 g、茯苓0.5 g、炙甘草0.4 g、牡丹皮0.75 g、梔子0.75 g和薄荷0.1 g（均粉碎，過4號篩）組成復方，加入一定量提取溶劑后，稱定質量，加熱回流提取；提取液濾過后放冷，用提取溶劑補足減失的質量，3 000 r/min離心15 min；取上清液1 mL，用提取溶劑定容至10 mL，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 分別精密量取“2.1.2”項下混合對照品溶液0、1、2、4、6、8、10、20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各指標成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得梔子苷、芍藥苷、丹皮酚的回歸方程分別為y＝1 483 728x－12 051（r＝0.999 5）、y＝927 308x－20 630（r＝0.997 5）、y＝5 116 603x－44 372（r＝0.999 9）。結果表明，梔子苷、芍藥苷、丹皮酚檢測進樣量線性范圍分別為0.074 9～1.498、0.056 2～1.124、0.033 4～0.668 μg。

2.1.5 方法學考察 分別進行精密度、穩定性、重復性試驗，分別測定梔子苷、芍藥苷和丹皮酚的峰面積。結果梔子苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD均小于3.0%，表明本試驗儀器精密度、方法重復性均較好，供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.1.6 樣品中各指標成分的含量測定及綜合評分 取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品中各指標成分的含量。以各指標成分的最高含量值為參照將數據進行歸一化，再按照各指標成分的權重（本研究將梔子苷、芍藥苷和丹皮酚的權重系數均設為1）計算得綜合評分：綜合評分（Y）＝（梔子苷含量/梔子苷最高含量+芍藥苷含量/芍藥苷最高含量+丹皮酚含量/丹皮酚最高含量）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數對綜合評分的影響 在提取時間2 h、液料比15∶1（V/m，mL/g）、提取2次的條件下，分別設置乙醇體積分數為20%、40%、50%、60%、70%、80%。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標成分含量測定并計算綜合評分，結果見圖2A。由圖2A可知，綜合評分隨乙醇體積分數的增大而先增加后趨于平緩并略有降低，當乙醇體積分數為60%時樣品綜合評分最高，故最終選擇60%乙醇為提取溶劑。

圖2 單因素試驗結果Fig 2 Results of single factor experiment

2.2.2 液料比對綜合評分的影響 在60%乙醇為提取溶劑、提取時間為2 h、提取2次的條件下，分別設置液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1（V/m，mL/g）。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標成分含量測定并計算綜合評分，結果見圖2B。由圖2B可知，綜合評分隨液料比的增大而先增加后降低最后趨于平緩，當液料比為15∶1（mL/g）時綜合評分最高，故最終選擇15∶1（mL/g）為液料比。

摩擦納米發電機等效電路模型研究……………………………………………………魏子鈞，耿來鑫，邊森 24-5-35

2.2.3 提取時間對綜合評分的影響 在60%乙醇為提取溶劑、液料比為15∶1（V/m，mL/g）、提取2次的條件下，分別設置提取時間為1.5、2、2.5、3、4 h。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標成分含量測定并計算綜合評分，結果見圖2C。由圖2C可知，綜合評分隨提取時間的延長而先增加后降低，當提取時間為3 h時綜合評分最高，故最終選擇3 h為提取時間。

2.2.4 提取次數對綜合評分的影響 在60%乙醇為提取溶劑、提取時間為2 h、液料比為15∶1（V/m，mL/g）的條件下，分別設置提取次數為1、2、3、4次。取處方配比藥材樣品（均粉碎，過4號篩）適量，分別進行加熱回流提取，按“2.1.6”項下方法進行各指標成分含量測定并計算綜合評分，結果見圖2D。由圖2D可知，綜合評分隨提取次數的增多而先增加后趨于平緩，當提取2次時綜合評分已高于2.95分，故最終選擇2次為提取次數。

2.3 BBD響應面法優化提取工藝

2.3.1 試驗設計與結果 在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert 8.0.5b軟件，以綜合評分為響應值，以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）和液料比（C，V/m）為因素，采用BBD響應面法進行3因素3水平試驗。因素與水平見表2，BBD響應面試驗設計與結果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 BBD響應面試驗設計與結果Tab 3 Design and results of BBD respone surface trial

2.3.2 模型擬合和方差分析 運用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗數據進行模型擬合，擬合得到的回歸模型為Y＝－15.116 47+0.402 85A+2.266 67B+0.283 86C－0.002 425AB+0.001 12AC－0.016 20BC－0.003 391 75A2－0.300 17B2－0.009 597C2（r＝0.991）。對該模型進行方差分析，結果見表4。由表4可知，該模型的P＜0.000 1，說明模型具有顯著性；失擬誤差的P＝0.065 70.05，說明失擬項不具有顯著性，即該模型對試驗數據的擬合情況較好，可較好地分析各因素對丹梔逍遙散指標成分提取的影響。方差分析結果顯示，模型中A、B、C、BC、A2、B2、C2對響應值影響顯著，AB、AC影響不顯著。經軟件分析可得最優提取工藝條件為60.88%乙醇提取3.11 h、液料比15.72∶1（mL/g），在此條件下可得綜合評分為2.895 24。

表4 方差分析結果Tab 4 Analysis results of variance

2.4 遺傳算法求解最優提取工藝條件

以“2.3.2”項下擬合模型為目標函數，使用Matlab 2014b軟件的GADS工具箱，采用遺傳算法求解指標成分的最優提取工藝條件。遺傳算法工具GUI參數設置見表5；隨機搜索10次，結果見表6。由表6可知，10次隨機搜索結果的變異范圍較小，對目標函數最佳值的逼近程度較好。因此，取10次隨機搜索的平均水平即60.872 000%乙醇提取3.105 564 h、液料比15.719 832∶1（mL/g），預測綜合評分為2.895 433。

表5 遺傳算法工具GUI參數設置Tab 5 GUI parameter setting of genetic algorithm tool

2.5 直接搜索算法求解最優提取工藝條件

以“2.3.2”項下擬合模型為目標函數，使用Matlab 2014b軟件的GADS工具箱，采用直接搜索算法求解最優提取工藝條件。直接搜索算法工具GUI參數設置見表7；隨機搜索10次，結果見圖3。

表6 遺傳算法搜索結果Tab 6 Search results of genetic algorithm tool

表7 直接搜索算法工具GUI參數設置Tab 7 GUI parameter setting of direct search method tool

由圖3可知，10次隨機搜索結果完全一致。即以60.871 948%乙醇提取3.105 560 h、液料比15.719 849∶1（mL/g），預測最優綜合評分為2.895 433。

2.6 最優提取工藝的確定及工藝驗證

根據實際情況，確定各因素結果的小數位數，得到BBD響應面法的提取工藝優化結果為60.88%乙醇提取3.1 h、液料比15.72∶1（mL/g）。經遺傳算法和直接搜索算法優化的最優提取工藝條件與之相差不大，其共同優化結果為60.87%乙醇提取3.1 h、液料比15.72∶1（mL/g）。分別按照以上兩種優化工藝條件進行驗證試驗，每種條件平行操作6次，并就綜合評分進行統計學配對t檢驗。結果，兩種工藝條件下的綜合評分比較差異無統計學意義（t＝－0.851，P＝0.434＞0.05），且樣品綜合評分平均值為2.903，即采用BBD響應面法或結合遺傳算法和直接搜索算法均可較好地對丹梔逍遙散中3個指標成分的提取工藝進行優化，且結果無顯著性差異。

圖3 直接搜索算法搜索結果Fig 3 Search results of direct search method pattern

3 討論

BBD響應面法是一種條件尋優的試驗設計方法，可將復雜的未知函數關系在小區域內用簡單的模型來擬合，其計算簡便，可減少試驗次數、降低成本等，具有可連續對試驗各水平進行分析的優勢。遺傳算法借鑒了生物界自然選擇和自然遺傳的機制，使原始數據在迭代過程中產生遺傳和變異，并從全局的角度去尋找最優試驗條件，可有效避免最優試驗條件選取時的主觀性和局部最優解問題。直接搜索算法可以作為上述優化方法的一個補充，其采用的是模式搜索方法，可搜索出最大、最小正基模式，處理邊界約束、線性等式、線性不等式，并且不需要函數可微或連續。但是以上3種方法均存在局限性：BBD響應面法要求設計的試驗點必須包括最優試驗條件，因此需要對各因素進行盡量精確的控制；遺傳算法和直接搜索算法均需事先獲得相對準確的目標函數，進而對目標函數進行最小值精確尋優。因此，先采用BBD響應面法建立數學模型、獲得目標函數后，再使用遺傳算法或直接搜索算法搜索各因素的精確最優值，在優化中藥提取工藝方面具有一定優越性。本試驗以乙醇體積分數、提取時間和液料比為考察因素，以復方丹梔逍遙散中3種活性成分的綜合評分為評價指標，采用BBD響應面法結合遺傳算法和直接搜索算法求解各因素的最憂取值，可為復方丹梔逍遙散的提取工藝研究提供一定參考。