三棱、莪術提取物聯合熱療對結腸癌SW620細胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響Δ

王振興，李水芹，趙梓亦，王飛

（1.成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院脾胃病科，成都 610073）

腹膜轉移癌（Peritoneal carcinomatosis，PC）是惡性腫瘤細胞經血管、淋巴管轉移至腹膜腔后最常見的繼發性腹膜腫瘤，也是惡性腫瘤晚期最常見的并發癥[1]。其臨床治療難度大，患者中位生存期短、預后差[2-3]。目前臨床上采用全身化療、腹腔化療和姑息性手術治療PC的療效不佳，而細胞減滅術聯合腹腔熱灌注化療（IHPC）是提高PC治療效果的主要措施[4]。IHPC是一種通過將恒溫（42～45℃）的化療藥液灌注入腹腔的治療方式，其在預防和治療腹膜種植轉移癌方面的作用已得到了國內外學者的廣泛重視[5]。但是由于化療藥物價格昂貴且存在骨髓抑制等毒副作用，使其與IHPC的聯合應用受到了很大限制[6]。

三棱、莪術是中藥配伍中常用的破血化瘀藥對[7]，《醫學衷中參西錄》載：“三棱氣味俱淡，微有辛意；莪術味微苦，氣微香，亦微有辛意；性皆微溫，為化瘀血之要藥。”本課題組在前期理論構建中將PC納入中醫學“癌毒”的范疇，并指出癌毒阻絡、氣滯血瘀是其主要病機[8-9]；在前期的臨床觀察中發現三棱、莪術組分配伍聯合IHPC治療惡性腫瘤晚期癌性腹水具有顯著的療效，且比單純化療藥物治療對患者的毒副作用更小。據此，本課題組認為將三棱、莪術組分聯合IHPC用于PC可能具有較好的臨床效果和較小的副作用。本課題組通過預實驗考察了三棱、莪術提取物聯合熱療對結腸癌細胞作用不同時間（0、6、12、24、48 h）的效果，發現其對腫瘤細胞的殺傷作用以作用24 h時為最強。因此，本研究選擇易發生腹膜轉移的結腸癌SW620細胞為對象，考察三棱、莪術提取物聯合熱療作用24 h時對腫瘤細胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響，為該療法臨床用于治療PC提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

3100型CO2培養箱（美國Fisher Scientific公司）；3-18K型冷凍離心機（美國Sigma公司）；X71型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Ⅱ型多功能酶聯免疫檢測儀（美國BioTek公司）；Navios流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；2C型精密電子天平（常州市幸運電子設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

三棱免煎顆粒、莪術免煎顆粒[四川新綠色藥業科技發展股份有限公司；兩種免煎顆粒分別為采用三棱（批號：4301730）、莪術（批號：1362172）藥材提取物制備所得的同批次制劑]；Matrigel基質膠、AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒（美國BD公司）；DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）、碘化丙啶（PI）、MTT試劑、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；胎牛血清、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司）；其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 細胞

結腸癌SW620細胞株購自American Type Culture Collection公司（編號：CLL-227），凍存于成都中醫藥大學附屬醫院中心實驗室。細胞以37℃溫水復蘇后，用含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養基在37℃、5%CO2培養箱中長期培養。

2 方法

2.1 三棱、莪術提取物的細胞毒性考察

采用MTT法測定藥物的細胞毒性。取對數生長期的SW620細胞，用DMEM培養基（以下簡稱“培養基”）調整細胞濃度至5×106個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養24 h。取三棱免煎顆粒，用PBS溶解制成相應質量濃度的藥液，按1.25、2.5、5、7.5、10 μg/mL加入各細胞孔；取莪術免煎顆粒，用PBS溶解制成相應質量濃度的藥液，按5、10、15、20、25 μg/mL加入各細胞孔；同時設置未經過藥物處理的空白組。各組細胞在37℃、5%CO2條件下培養24 h后，于顯微鏡下觀察細胞狀態；棄去培養基，每孔加入PBS 100 μL、5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續在37 ℃、5%CO2條件下培養4 h；棄去培養基，每孔加入DMSO 150 μL，充分震蕩至結晶物完全溶解。采用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測定吸光度（A），計算藥物對SW620細胞的抑制率[抑制率＝（1－A加藥組/A空白組）×100%]；同時，繪制細胞增殖抑制曲線，求算30%細胞生長抑制濃度（IC30）、50%細胞生長抑制濃度（IC50）。

2.2 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞死亡情況的影響考察

采用CFSE/PI雙熒光染色法考察細胞死亡情況。取對數生長期、融合度為50%～80%的SW620細胞，分為空白對照組（不作熱療處理，不加藥）、IC50三棱提取物組、IC50三棱提取物+熱療組、IC50莪術提取物組、IC50莪術提取物+熱療組。其中IC50三棱提取物+熱療組、IC50莪術提取物+熱療組細胞先在42℃條件下放置90 min進行熱療處理。將經過熱療處理或未經熱療處理的各組細胞接種于12孔板（5×105個/孔），在37℃、5%CO2條件下培養24 h使細胞貼壁。然后加入5 μmol/L CFSE染色液，在37℃、5%CO2條件下培養30 min；棄去培養基，按不同分組加入新鮮培養基或含有相應藥物（三棱提取物為4.69 μg/mL，莪術提取物為16.81 μg/mL）的新鮮培養基，繼續培養24～48 h；棄去培養基，加入10 μg/mL PI-PBS染色液2 mL，于37℃、5%CO2條件下培養10 min；PBS沖洗細胞5 min×3次。每組設置3個復孔。采用熒光倒置顯微鏡觀察細胞死亡情況（綠色熒光陽性/紅色熒光陰性者為活細胞，綠色熒光陽性/紅色熒光陽性者為死細胞）。

2.3 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞凋亡率的影響考察

為進一步確認三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞凋亡的影響，采用FITC標記的AnnexinⅤ試劑和PI試劑對SW620細胞進行雙染色，并通過流式細胞術分析細胞凋亡情況。按“2.2”項下方法分組并進行熱療處理和給藥，每組設置3個復孔。然后用0.25%胰蛋白酶消化處理后的細胞，制備單細胞懸液，以PBS調整細胞終濃度至1×106個/mL。然后加入AnnexinⅤ-FITC 試劑20 μL和PI試劑5 μL進行雙染色，輕柔混勻，室溫下避光反應15 min，再加入PBS 300 μL，立即采用流式細胞儀進行檢測。

2.4 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞遷移能力的影響考察

采用劃痕實驗考察細胞遷移能力。用記號筆在6孔板的背面均勻劃橫線，各3條。取對數生長期SW620細胞接種于孔內（1×106個/孔），在37 ℃、5%CO2條件下培養過夜，至次日細胞鋪滿板底。將細胞分為空白對照組（不作熱療處理，不加藥）、IC30三棱提取物組、IC30三棱提取物+熱療組、IC30莪術提取物組、IC30莪術提取物+熱療組，按“2.2”項下方法進行熱療處理和給藥（三棱提取物為3.24 μg/mL，莪術提取物為11.27 μg/mL），每組設置3個復孔。用微量移液槍頭進行劃痕，劃痕盡量與記號筆橫線垂直，不能傾斜；用PBS沖洗細胞3次，去除劃痕后漂浮的細胞；然后在每孔中加入含1%胎牛血清的培養基2 mL，37℃、5%CO2條件下培養24 h。在倒置顯微鏡下隨機選擇5個獨立視野觀察劃痕愈合情況。

2.5 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞侵襲能力的影響考察

采用Transwell侵襲實驗考察細胞侵襲能力。取－80℃下保存的Matrigel基質膠于4℃過夜解凍。取培養基與Matrigel基質膠按5∶1體積比混勻后，分別取100 μL加入各個Transwell小室，于37℃下放置至凝固。取對數生長期SW620細胞，用0.25%胰蛋白酶消化液懸浮，用PBS調整細胞濃度至1×106個/mL，然后取100 μL輕柔加入Transwell小室上層；在下室中加入含10%胎牛血清的培養基500 μL。按“2.4”項下方法分組并進行熱療處理和給藥，每組設置3個復孔。各組細胞在37℃、5%CO2條件下培養24 h后，以PBS清洗Transwell小室3次，以5%戊二醛溶液固定，4℃下放置10 min。加入0.1%結晶紫溶液，室溫下染色30 min，以PBS沖洗Transwell小室，并用棉球擦去表面細胞。在倒置顯微鏡下觀察，并隨機選擇5個獨立視野計算陽性染色細胞數。

2.6 統計學方法

數據采用SPSS 23.0統計軟件進行處理。計量資料以x±s表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料使用χ2檢驗進行組間比較，用Fisher確切概率法進行雙向檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 三棱、莪術提取物的細胞毒性

結果顯示，隨著三棱、莪術提取物質量濃度的增加，其對SW620細胞的抑制率也相應升高。不同質量濃度三棱、莪術提取物作用后的細胞增殖抑制曲線見圖1。根據該曲線求算得三棱提取物IC30為3.24 μg/mL，IC50為4.69 μg/mL；莪術提取物IC30為11.27 μg/mL，IC50為16.81 μg/mL。

圖1 不同質量濃度三棱、莪術提取物作用后的細胞增殖抑制曲線Fig 1 Cell proliferation inhibition curve after treated with different concentrations of S.stoloni extract or C.zedoaria extract

3.2 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞死亡情況的影響

結果顯示，與IC50三棱提取物組或IC50莪術提取物組比較，IC50三棱提取物+熱療組或IC50莪術提取物+熱療組的死亡細胞顯著增多，且在明場條件下可見其細胞皺縮更明顯，表明細胞存活狀態更差。各組細胞CFSE/PI雙熒光染色顯微圖見圖2。

圖2 各組細胞CFSE/PI雙熒光染色顯微圖（×40）Fig 2CFSE/PI double fluorescent staining microgram of cells in each group（×40）

3.3 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞凋亡率的影響

結果顯示，IC50三棱提取物組細胞的凋亡早期率為0.3%、凋亡中晚期率為1.4%、壞死率為5.2%，IC50三棱提取物+熱療組細胞的凋亡早期率為0.9%、凋亡中晚期率為3.8%、壞死率為12.6%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；IC50莪術提取物組細胞的凋亡早期率為7.8%、凋亡中晚期率為4.4%、壞死率為2.0%，IC50莪術提取物+熱療組細胞的凋亡早期率為1.3%、凋亡中晚期率為4.4%、壞死率為16.2%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。這表明三棱、莪術提取物聯合熱療可明顯提高SW620細胞的凋亡率。各組細胞Annexin V/PI雙染色流式細胞圖見圖3。

3.4 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞遷移能力的影響

結果顯示，與0 h比較，空白對照組細胞在24 h時的劃痕愈合間距明顯變窄，而IC30三棱提取物組、IC30三棱提取物+熱療組、IC30莪術提取物組、IC30莪術提取物+熱療組細胞在24 h時的劃痕愈合間距未見明顯變窄。各組細胞劃痕實驗顯微圖見圖4。

3.5 三棱、莪術提取物聯合熱療對細胞侵襲能力的影響

圖3 各組細胞AnnexinⅤ/PI雙染色流式細胞圖Fig 3 AnnexinⅤ/PI double staining flow cytometry of cells in each group

結果顯示，與空白對照組比較，IC30三棱提取物組、IC30三棱提取物+熱療組、IC30莪術提取物組、IC30莪術提取物+熱療組在24 h時跨膜細胞數均顯著減少，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與IC30三棱提取物組或IC30莪術提取物組比較，IC30三棱提取物+熱療組或IC30莪術提取物+熱療組在24 h時跨膜細胞數均顯著減 少，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明熱療加強了藥物對SW620細胞侵襲能力的抑制作用。其中，IC30三棱提取物+熱療組跨膜細胞數從IC30三棱提取物組的（152±23）個/視野減少至（31±6）個/視野，IC30莪術提取物+熱療組跨膜細胞數從IC30莪術提取物組的（189±41）個/視野減少至（67±15）個/視野。各組細胞Transwell侵襲實驗顯微圖見圖5，跨膜細胞數柱形圖見圖6。

圖4 各組細胞劃痕實驗顯微圖（×40）Fig 4Microgram of cell scratch test in each group（×40）

圖5 各組細胞Transwell侵襲實驗顯微圖（結晶紫染色，×100）Fig 5 Microgram of Transwell invasion test in each group（crystal violet staining，×100）

圖6 各組跨膜細胞數柱形圖Fig 6 Columnar graph of the number of transmembrane cells in each group

4 討論

IHPC是近年興起的一種腹腔惡性腫瘤治療手段，對各種腹腔惡性腫瘤的腹膜轉移均具有可靠的臨床療效[10]。IHPC通過持續高溫作用（42～43℃條件下作用90 min），能在不影響正常組織的情況下誘導腫瘤細胞凋亡；同時高溫（＞41℃）可提高化療藥物進入腫瘤細胞的效率來達到更佳的腫瘤抑制效果[11]。

三棱、莪術是具有破血祛瘀、行氣止痛功效的常用藥對[7]，具有悠久的中醫臨床應用歷史，是歷代醫家治療癥瘕積聚的常用藥物[12]。著名醫家王好古在《湯液本草》中曾言：“三棱，破血中之氣，肝經血分藥也。三棱、莪術治積塊瘡硬者，乃堅者削之也。”除了傳統中醫應用，三棱、莪術近年來在臨床抗腫瘤治療方面的應用也日趨廣泛，包括用于宮頸癌[13]、肺癌[14]、胃癌[15]、白血病[16]等的治療。三棱、莪術配伍后具有抗血栓、改善血液流變學、抗腫瘤、抗纖維化、增強免疫力等藥理作用[17-20]。

本研究主要考察三棱、莪術提取物分別聯合熱療對結腸癌SW620細胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響，結果發現相對于三棱提取物組或莪術提取物組，三棱提取物+熱療組或莪術提取物+熱療組的細胞死亡數量增加、凋亡率顯著升高，細胞的遷移和侵襲能力顯著減弱。由此可見，聯用熱療能夠明顯增強三棱或莪術提取物對SW620細胞的殺傷作用以及對其遷移和侵襲能力的抑制作用。本課題組下一步考慮將三棱、莪術的有效成分進行配伍并與熱療聯用于SW620細胞，并選用更高熱療溫度以增強對腫瘤細胞的殺傷作用，同時進一步探索該療法聯合中藥用于治療PC等腫瘤的分子生物學機制。