正五聚蛋白3在急性冠狀動脈綜合征合并抑郁癥診斷及治療中的意義Δ

陳松海，劉秋瓊，林秋曉，李廣華，黃 革（廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院藥劑科，廣州 510080）

急性冠狀動脈綜合征（ACS）是一種病死率較高的常見心血管急癥，其發病及預后除與生物因素有關外，還與患者的個體情緒有關[1]。相關研究表明，抑郁癥是ACS的獨立危險因素，嚴重影響ACS患者的預后[2]。ACS常伴隨著炎癥因子[如白細胞介素6（IL-6）、IL-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）等]的急速釋放[3-4]，導致血腦屏障受到破壞[5]，使得上述炎癥因子進入大腦，引發神經炎癥，最終導致抑郁癥狀的出現[6-7]。研究指出，抑郁癥患者同時也存在炎癥因子水平升高的情況[8-9]。由此可見，炎癥因子在ACS與抑郁癥的發病過程中具有重要的連接作用。因此，深入探討ACS合并抑郁癥患者體內相關炎癥因子含量的變化，可能成為其臨床治療的突破口。

正五聚蛋白3（PTX-3）作為急性期炎癥反應蛋白，能夠直接反映血管病變的炎癥狀態[10]。近年來，PTX-3被認為是ACS的生物標志物，其含量可反映ACS的炎癥嚴重程度[11]。本課題組前期研究發現，PTX-3在慢性溫和不可預知應激（CUMS）抑郁癥模型大鼠血漿中的表達水平顯著升高，可將其作為抑郁程度的評價指標[12]；亦有臨床研究證實，抑郁癥患者外周血中PTX-3 mRNA的表達水平異常升高[13]。因此，本課題組推測PTX-3可作為ACS合并抑郁癥診斷及治療中的考察指標。鑒于目前未見探討PTX-3與ACS合并抑郁癥相關性的報道，本研究在現有文獻基礎上，采用回顧性研究方法，探討ACS或抑郁癥、ACS合并抑郁癥患者體內PTX-3的表達差異，旨在進一步明確PTX-3能否成為ACS合并抑郁癥診斷的早期生物標志物；同時，考察經不同藥物治療后上述患者體內PTX-3表達水平的變化情況，以期為臨床考察指標的選擇和治療方法的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HH-6型數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器廠）；Megafuge 2.0R型低溫高速離心機（德國Hermle公司）；THM51119300型全波長酶標分析儀、TCA4848型梯度聚合酶鏈反應（PCR）儀、Nano Drop 2000型超微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CFX96型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸舍曲林片（輝瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H10980141，批號：W09036，規格：50 mg）；逍遙丸[廣州白云山敬修堂藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字Z44020869，批號：150602，規格：丸劑（水丸）]；阿司匹林腸溶片（德國Bayer Vital GmbH公司，注冊證號：H20130339，批號：20150821，規格：100 mg）；通心絡膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字Z19980015，批號：A1508019，規格：每粒裝0.26 g）。

人外周血單核細胞分離試劑盒（含試劑A、試劑D、清洗液等試劑，北京索萊寶科技有限公司，批號：90151103）；PTX-3酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：P18012809）；RNA提取試劑（批號：AKA5601）、反轉錄試劑盒（批號：AK4901）、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（含SYBR熒光染料、去RNA酶滅菌水等試劑，批號：AHX1018N）均購自寶生物工程（大連）有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）（美國Sigma-Aldrich公司，批號：WXBB3108）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國 HyClone公司，pH＝7.4，批號：AC11223329）；甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH，實驗室自制）；氯仿、乙醇、異丙醇等均為分析純，水為超純水。

2 資料與方法

2.1 研究對象

2.1.1 ACS組 選取我院2015年12月－2018年3月收治的ACS住院患者作為ACS組。納入標準：符合《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》[14]中ACS的診斷標準，包括不穩定型心絞痛（UAP）、非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）、ST段抬高型心肌梗死（STEMI）。排除標準：嚴重心力衰竭、急性腦卒中者；肺部感染、慢性阻塞性肺疾病者；重癥肝炎、肝腎功能衰竭者；甲狀腺功能亢進者；心肌炎、肥厚性心肌病者；結締組織病患者；血液病患者；其他感染及壞死性疾病患者；惡性腫瘤患者；妊娠期或哺乳期婦女。該組共納入ACS患者84例。

2.1.2 抑郁癥組 選取我院同期收治的抑郁癥住院患者作為抑郁癥組。納入標準：符合《中國精神疾病分類與診斷標準第3版（精神障礙分類）》[15]中抑郁癥的診斷標準，漢密爾頓抑郁量表（HAMD）評分≥20分[16]。排除標準：妊娠期或哺乳期婦女；具有器質性精神障礙或者由精神活性物質所致的精神障礙者；嚴重心、肝、腎等實質性臟器損害者；神經系統變性疾病患者；語言聽力功能障礙者。該組共納入抑郁癥患者85例。

2.1.3 ACS合并抑郁癥組 選取我院同期收治的ACS合并抑郁癥住院患者作為ACS合并抑郁癥組，納入與排除標準同“2.1.1”“2.1.2”項。該組共納入ACS合并抑郁癥患者80例，根據患者治療方法的不同又分為化學藥治療組（40例）和中成藥治療組（40例）。

2.1.4 對照組 選取同期于我院進行體檢的健康受試者作為對照組。納入標準：①年齡≥18歲；②無腫瘤標志物和鐵蛋白增高等肺癌相關高危因素[17]；③常規體檢及肝腎功能無異常。排除標準：①依從性差，不愿意加入本研究者；②研究者認為不適宜的其他情況。該組共納入受試者90例。

本研究經我院醫學倫理委員會審核批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。各組受試者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 治療方法

2.2.1 ACS組 ACS組患者接受阿司匹林腸溶片（50～150 mg/次，qd）+通心絡膠囊（2～4粒/次，tid）連續治療4周。

2.2.2 抑郁癥組 抑郁癥組患者接受鹽酸舍曲林片（50 mg/次，qd）+逍遙丸（9 g/次，bid）連續治療4周。

2.2.3 ACS合并抑郁癥組 化學藥治療組患者接受阿司匹林腸溶片+鹽酸舍曲林片治療，中成藥治療組患者接受通心絡膠囊+逍遙丸治療，用法用量同“2.2.1”“2.2.2”項。

2.3 PTX-3含量的測定

所有受試者分別于治療前后晨起空腹抽取靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中。取一半靜脈血以2 500 r/min離心10 min，收集上層血漿，采用ELISA法以全波長酶標分析儀于450 nm波長處測定吸光度并計算其中PTX-3的含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。另一半血樣用于測定PTX-3 mRNA的表達水平。

2.4 PTX-3 mRNA表達水平的測定

2.4.1 外周血單核細胞分離 嚴格按人外周血單核細胞分離試劑盒說明書操作。取15 mL離心管，依次加入總體積與血漿樣品等同的試劑A、試劑D（體積比為3∶2），隨后加入血漿樣品適量，以2 700 r/min離心30 min。吸取細胞層至另一15 mL離心管中，加入清洗液10 mL，混勻，以1 900 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀以清洗液5 mL重懸，以2 700 r/min離心10 min后，用清洗液清洗3次，每次5 mL，棄去上清液，即得外周血單核細胞樣品。然后加入RNA提取試劑0.5 mL，于－80℃凍存，備用。

2.4.2 總RNA的提取 將“2.4.1”項下所得單核細胞樣品于室溫下放置，混勻，于室溫下靜置10 min，加入氯仿100 μL，混勻，于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min。吸取上層水相至另一1.5 mL離心管中，加入3倍體積的異丙醇（4℃預冷）混勻，于4℃靜置20 min，以15 000 r/min離心15 min以沉淀RNA。吸棄上清液，沉淀用75%乙醇200 μL清洗1次，以15 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入滅菌水（含0.1%DEPC）20 μL以溶解RNA，于－80℃凍存，備用。

2.4.3 PTX-3 mRNA表達水平的測定 采用RT-PCR法以熒光定量PCR儀測定所有受試者單核細胞中PTX-3 mRNA的表達水平。采用反轉錄試劑盒以梯度PCR儀將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA）。根據Genbank數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的基因表達序列，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計引物（序列見表1）。PCR反應體系（總體積為25 μL）：含2×SYBR熒光染料12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA2 μL，去RNA酶滅菌水8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。采用熔解曲線評估PCR反應結果（熔解曲線峰形單一則表明特異性良好）。以GAPDH為內參，以對照組受試者血漿為對照樣本，按2－ΔΔCt法計算目標mRNA的相對表達量，ΔΔCt＝ΔCt待測樣本－ΔCt對照樣本（其中，ΔCt＝Ct目標基因－Ct內參基因；Ct值表示每個反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數）。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2.5 療效及安全性評價

2.5.1 療效評價 通過12導聯心電圖、動態心電圖等觀察ACS患者治療前后ST-T段改變以及心絞痛、室性心律失常、室性心動過速、心室顫動、心力衰竭、心肌梗死、心源性猝死等的發生情況，并按以下標準判定心血管癥狀療效——顯效：患者上述癥狀明顯改善；有效：癥狀有所改善；無效：癥狀無明顯改善或惡化；總有效＝顯效+有效[14]。采用HAMD量表評價抑郁癥患者治療前后的抑郁癥狀，計算其HAMD評分減分率[減分率（%）＝（治療前總分－治療后總分）/治療前總分×100%]，并按以下標準判定抑郁癥狀療效——顯效：精神癥狀基本消失，HAMD評分減分率≥50%；有效：精神癥狀減輕并有緩解，HAMD評分減分率≥25%；無效：精神癥狀無明顯改善或加重，HAMD評分減分率＜25%；總有效＝顯效+有效[15-16]。

2.5.2 安全性評價 記錄所有患者治療前后肝功能、腎功能、血常規、尿常規等實驗室指標，并觀察其不良反應發生情況。

2.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用配對t檢驗；計數資料以例數或率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組受試者治療前血漿PTX-3含量及mRNA表達水平比較

治療前，ACS組、抑郁癥組、ACS合并抑郁癥組患者血漿PTX-3含量及mRNA相對表達量均顯著高于對照組，且ACS合并抑郁癥組顯著高于ACS組、抑郁癥組，差異均有統計學意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 各組受試者治療前血漿PTX-3含量及mRNA相對表達量比較（x±s）Tab 2 Comparison of plasma contents of PTX-3 and its mRNA expression in each group before treatment（x±s）

3.2 各組患者治療前后血漿PTX-3含量及mRNA表達水平比較

治療后，ACS組、抑郁癥組、ACS合并抑郁癥化學藥治療組和中成藥治療組患者血漿PTX-3含量及mRNA相對表達量均較治療前顯著下降，且ACS合并抑郁癥化學藥治療組患者上述指標治療前后的差值顯著高于其他各組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；而其他各組上述指標治療前后的差值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表3、表4。

表3 各組患者治療前后血漿PTX-3含量比較（x±s）Tab 3 Comparison of plasma contents of PTX-3 in each group before and after treatment（x±s）

3.3 各組患者療效與安全性比較

ACS組、ACS合并抑郁癥化學藥治療組和中成藥治療組患者經相應藥物治療后，心血管癥狀均有不同程度的改善，其總有效率分別為80.9%、77.5%、72.5%，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表5。

抑郁癥組、ACS合并抑郁癥化學藥治療組和中成藥治療組患者經相應藥物治療后，抑郁癥狀均有不同程度的改善，其總有效率分別為84.7%、82.5%、77.5%，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表6。

表4 各組患者治療前后血漿PTX-3 mRNA相對表達量比較（x±s）Tab 4 Comparison of relative expression of PTX-3 mRNA in plasma in each group before and after treatment（x±s）

表5 各組患者心血管癥狀療效比較[例（%%）]Tab 5 Comparison of therapeutic efficacies of cardiovascular symptoms in each group[case（%%）]

表6 各組患者抑郁癥狀療效比較[例（%%）]Tab 6 Comparison of the therapeutic efficacies of depression symptoms in each group[case（%%）]

ACS合并抑郁癥中成藥治療組中有3例患者服用通心絡膠囊后出現輕微胃腸道不適，經停藥后癥狀好轉；除此之外，其余患者均未見明顯不良反應發生。

4 討論

4.1 PTX-3為ACS合并抑郁癥的關鍵因子

ACS是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破潰、繼發完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的臨床綜合征，包括UAP、NSTEMI、STEMI等類型，其不穩定斑塊破裂和隨之發生的血小板聚集及血栓形成是導致患者發病的主要機制[18]。近年來有研究指出，冠狀動脈炎癥在動脈粥樣硬化斑塊不穩定方面起著重要作用[19]。ACS不僅可給患者造成嚴重的身體痛苦，而且還可造成重大的精神刺激，以焦慮和抑郁最為常見[20]。而這些情緒障礙均可促發或加重心絞痛、心肌梗死、心律失常、心力衰竭等癥狀，甚至可導致患者死亡[21]。

PTX-3可直接反映血管的炎癥狀態，是ACS的診斷指標之一[11，22]。目前關于PTX-3與抑郁癥相關性的報道較少，特別是ACS合并抑郁癥方面尚未見相關報道。本研究結果表明，與對照組受試者比較，ACS組、抑郁癥組、ACS合并抑郁癥組患者治療前血漿PTX-3含量及mRNA相對表達量均顯著升高，差異均有統計學意義。這提示PTX-3可能參與上述疾病的發生與發展。此外，本研究結果還顯示，ACS合并抑郁癥組患者上述指標水平均顯著高于ACS組、抑郁癥組。筆者分析其原因可能為：ACS為一種炎癥疾病，機體炎癥反應可誘發動脈粥樣硬化，并且炎癥因子也可通過損傷血管內皮細胞而增加血栓形成的風險，導致與抑郁相關的神經細胞受到損傷[23]，與此同時，隨著血管炎癥反應的加劇，PTX-3含量及mRNA相對表達量相應升高。

4.2 藥物治療對PTX-3表達的影響

抗血小板藥物能夠有效降低患者心血管事件的發生率。阿司匹林對血小板聚集有抑制作用，可阻止血栓形成；通心絡膠囊是純中藥制劑，具有益氣活血、通絡止痛的功效；兩者均具有良好的抗血小板作用，可用于ACS的臨床治療[24-25]，兩者聯用可有助于抑制患者動脈粥樣硬化、減少炎癥反應、減輕血管內皮細胞損傷[26-27]。鹽酸舍曲林是一種新型抗抑郁藥，可用于治療抑郁癥和焦慮障礙，具有療效顯著、安全性好、耐受性強等優點[28]；逍遙丸為中醫經典方劑，含柴胡、當歸、白芍、炒白術、茯苓、炙甘草、薄荷等藥材，具有疏肝解郁的功效，是臨床用于肝郁病癥治療的首選中成藥[29]；兩者聯用能夠快速、有效地改善患者的抑郁癥狀[30]。

本研究結果顯示，經過4周治療后，各方案對患者心血管及抑郁癥狀均具有一定的治療效果，且安全性均較高。阿司匹林腸溶片、通心絡膠囊能顯著降低ACS患者血漿PTX-3含量，鹽酸舍曲林片、逍遙丸能顯著降低抑郁癥患者血漿PTX-3含量。筆者推測上述藥物對ACS、抑郁癥的治療作用可能與下調患者體內PTX-3表達有關，但具體機制有待進一步證實。此外，與ACS合并抑郁癥中成藥（逍遙丸+通心絡膠囊）治療組比較，ACS合并抑郁癥化學藥（鹽酸舍曲林片+阿司匹林腸溶片）治療組患者體內PTX-3含量及mRNA相對表達量均有更顯著的改善（以上述指標治療前后的差值進行衡量）。筆者認為這可能與本研究周期較短而化學藥起效較中成藥更快[31]有關。

綜上所述，ACS、抑郁癥、ACS合并抑郁癥患者體內PTX-3的表達均較健康受試者更高；藥物治療均可顯著降低上述患者體內PTX-3的表達水平，且化學藥的作用在短期內更明顯。因此，PTX-3可作為ACS合并抑郁癥診斷及治療的生物標志物。但由于本研究收集的臨床資料不夠全面，同時缺乏臨床治療指標與PTX-3表達之間的相關性分析，故本研究結論仍有待進一步確證。