新疆釀酒葡萄表皮乳酸菌的分離鑒定及耐受性分析

姜 蕾，周雪燕，王 斌，肖 婧，程衛東，史學偉*

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學 信息科學與技術學院，新疆 石河子 832000）

葡萄酒釀造是由多種微生物共同參與的代謝過程，在沒有人工外源接種的情況下，一般可以認為其表皮微生物源自釀酒葡萄本身[1]。葡萄酒中的細菌主要是乳酸菌[2]，目前乳酸菌主要分為明串珠菌屬（Leuconostoc）、酒球菌屬（Oenococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）[3]四大類。其對葡萄酒最重要的作用是進行蘋果酸-乳酸發酵，蘋果酸-乳酸發酵可使葡萄酒的酸度下降、口味柔和[4]。蘋果酸-乳酸發酵主要由乳酸菌啟動并執行，在蘋果酸-乳酸發酵過程中，葡萄酒中的L-蘋果酸經脫羧反應轉化成乳酸和二氧化碳，從而降低葡萄酒的酸度，提高葡萄酒的感官特性和微生物的穩定性[5]。常見的乳酸菌分離方法主要有MRS培養基直接分離法[6]、富集法[7]和超膜過濾法[8]。

有研究表明，pH、酒精濃度、SO2等是影響葡萄酒中乳酸菌作用的主要因素[2，9]。吳正坤等[10]采用高通量測序從大曲中分離得到18株乳酸菌，耐受性分析結果表明菌株耐受8%乙醇和pH 3.5。因此，本試驗通過對釀酒葡萄表皮乳酸菌的分離、鑒定、耐受性分析，篩選出適合新疆葡萄品質發酵的乳酸菌，從而啟動并控制葡萄酒中的蘋果酸-乳酸發酵，提升新疆本土葡萄酒質量，為制作新疆特色葡萄酒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

赤霞珠（CXZ）、美樂（ML）、霞多麗（XDL）、黑比諾（HBN）、貴人香（GRX）：新疆瑪納斯釀酒葡萄栽培區，5個品種的葡萄樣品10例。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂粉、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、氯化氫、檸檬酸鈉、氯化鈉（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；Easy Pure Bacteria Genomic脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；EasyTaqSuper mix、DNA Marker、Gold view：北京博奧拓達科技有限公司。

1.1.3 培養基

篩選培養基（MRS培養基）[11]：葡萄糖2%，乙酸鈉0.5%，蛋白胨1%，磷酸氫二鉀0.2%，酵母膏0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，硫酸錳0.000 5%，硫酸鎂0.02%，吐溫80 1 mL，瓊脂2%（固體培養基添加），蒸餾水配制，pH 6.2～6.6，121℃高壓滅菌20 min。

菌株耐受性試驗所用培養基均在MRS培養基的基礎上進行改良[12]。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH，115℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：英國Techne公司；Power Pac Universal電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統：美國BioRad公司；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋：浙江新豐醫療器械有限公司；722光柵紫外分光光度計、標準型pH計：上海精密科學儀器有限公司；Bnp-9272智能生化培養箱：上海精宏試驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將無菌操作采集的葡萄樣品浸泡在無菌生理鹽水中，28℃、170 r/min條件下培養0.5 h。

1.3.2 菌種的分離純化

樣品預處理液經梯度稀釋，選取10-2、10-3、10-4、10-5濃度梯度進行涂布，每種梯度中吸取100 μL菌液于MRS固體培養基上，涂布均勻，每個樣品涂布3個平板。28℃條件下倒置培養48h。選取平板中菌落特征（菌落直徑、形態和顏色等）不同的單菌落，在MRS固體培養基上分離、純化2～3次，直至平板上無不同菌落特征菌株[13-14]。其中革蘭氏染色陽性菌、接觸酶試驗陰性的菌株暫定為乳酸菌。

1.3.3 菌種的鑒定

形態學鑒定：參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[15]與《伯杰細菌鑒定手冊》[16]對其形態特征進行判斷。

分子生物學鑒定：采用EasyPureBacteriaGenomicDNA試劑盒提取乳酸菌的DNA，以其為模板進行PCR擴增[17-19]。上游引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物為1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴增體系為模板DNA 2 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，EasyTaqSupermix 25 μL，雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴增程序[20]為95℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環30次；再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳[21]檢測。

將電泳檢測合格的PCR擴增產物送至上海生工生物有限公司進行測序。測序完成后將測序基因進行拼接，然后使用美國國立生物信息技術中心（national center for biotech nology information，NCBI）數據庫中的BLAST工具進行同源性比對，獲得同源性較高的菌株，使用ClustalW程序將菌株序列進行比對分析，然后采用軟件Mega 6.0中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹[22]。

1.3.4 乳酸菌株的耐受性分析

菌株活化：取200μL保藏的菌株接種于10mLYEPD液體培養基中，在28℃條件下培養48 h。

pH耐受性試驗：取活化完成并進入穩定對數期的菌液按4%（V/V）的接種量分別接種于pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的MRS液體培養基中，30℃條件下培養48 h，每組設置3個平行，利用比濁法[23]每隔6 h測定一次培養菌液的OD600nm值，收集數據并繪制供試菌株的生長曲線。

耐鹽性試驗：取培養至穩定對數期的菌液，按照4%的接種量分別接種于氯化鈉含量為0、6%、7%、8%、9%、10%的MRS液體培養基中，30℃條件下培養48 h，每組設置3個平行，每隔6 h測定一次培養菌液的OD600nm值，收集數據并繪制供試菌株的生長曲線。

乙醇耐受性試驗：將培養至穩定對數期的菌液按照4%的接種量分別接種于無水乙醇體積分數為0、9%、10%、11%、12%、13%的MRS液體培養基中，30℃條件下培養48h，每組設置3個平行，每隔6 h測定一次培養菌液的OD600nm值，收集數據并繪制供試菌株的生長曲線。

SO2耐受性試驗：取培養至穩定對數期的菌液按照4%的接種量接種于SO2質量濃度分別為0、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L的MRS液體培養基中，30℃條件下培養48 h，每組設置3個平行，每隔6 h測定一次培養菌液的OD600nm值，收集數據并繪制供試菌株的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從10個葡萄樣品中初步篩選得到37株乳酸菌，分別編號為axb65-axb102，并對篩選的菌種在MRS固體培養基表面的形態特征進行判斷，初步分為4類（I、II、III、IV），分離菌株的菌落形態與細胞形態見圖1、表1。

由圖1和表1可知，菌株在MRS培養基中生長狀況良好，單菌落呈乳白色，奶油狀，中間有凸起，邊緣整齊且光滑。通過革蘭氏染色顯微觀察，菌株均為革蘭氏陽性菌，桿狀，個體微小，無鞭毛與芽孢，符合乳酸菌基本特征。

圖1 各類型代表菌株在MRS培養基上的菌落與細胞形態Fig.1 Colony and cell morphology of each type of representative strains on MRS media

表1 MRS培養基上乳酸菌的形態特征Table 1 Morphological characteristics of lactic acid bacteria on MRS media

2.2 分子生物學鑒定

2.2.1 16S rDNA PCR擴增產物電泳檢測結果

選取4種表型中生長較好的菌株各1株，分別為菌株axb74、axb79、axb80、axb81，提取其DNA并進行PCR擴增，PCR擴增產物電泳檢測結果如圖2所示。

圖2 乳酸菌PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products from lactic acid bacteria

由圖2可知，在1500bp左右出現了特異性擴增條帶，且條帶較為明亮，PCR擴增產物符合測序標準。

2.2.2 乳酸菌株的系統發育分析

基于菌株axb74、axb79、axb80、axb81的16S rDNA序列分析構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株axb81、axb79、axb80與檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）聚于一支，菌株axb74與乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）聚于一支。結合形態觀察結果，將菌株axb79、axb80、axb81確定為檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），菌株axb74為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcuslactissubsp.lactis）。所以選取具有代表性的菌株axb74和axb79進行耐受性分析。

圖3 基于16S rDNA基因序列分析乳酸菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences analysis

2.3 乳酸菌的耐受性分析

2.3.1 乳酸菌的pH耐受性分析

圖4 乳酸菌axb74（A）與axb79（B）的pH耐受性測定結果Fig.4 Determination results of pH tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

由圖4可知，隨著pH值的降低，菌株axb74與axb79的生長受到了不同程度的抑制。在pH值為2.5的極酸環境下，兩株菌的生長均受到了強烈抑制；菌株axb79在pH值為3.0的環境中OD600nm值為0.16，生長速率緩慢；菌株axb74在pH為3.5的環境中OD600nm值為0.18，菌株正常生長，而在pH＜3.0的環境中生長速率無明顯提高。因此菌株axb74、axb79最高耐受的pH值分別為3.5、3.0。

2.3.2 乳酸菌的乙醇耐受性分析

由圖5可知，隨著乙醇含量的上升，菌株axb74與axb79的生長速率逐漸降低。當乙醇含量為12%時，菌株axb74的OD600nm值為0.14，生長速率緩慢上升；當乙醇含量增加至13%時，OD600nm值始終保持在0.04左右，生長速率無明顯增加。當乙醇含量為11%時，菌株axb79的OD600nm值為0.13，生長速率緩慢增加；但當乙醇含量為12%、13%時，菌株axb79的OD600nm值均為0.035，生長速率無明顯上升。因此，菌株axb74、axb79的最高耐受乙醇含量分別為12%、11%。

圖5 乳酸菌axb74（A）與axb79（B）的乙醇耐受性測定結果Fig.5 Determination results of ethanol tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

2.3.3 乳酸菌鹽耐受性分析

由圖6可知，隨著NaCl含量的增加，菌株axb74與axb79的生長受到了不同程度的抑制。菌株axb74在NaCl含量為8%的環境中OD600nm值為0.18，生長速率緩慢上升，而在NaCl含量為9%、10%的環境中OD600nm值均為0.05。菌株axb79在NaCl含量為9%的環境中OD600nm值為0.19，延滯期延長至24 h，生長速率緩慢增加，而在NaCl含量為10%的環境中生長速率無明顯提升，OD600nm值為0.03。因此，菌株axb74、axb79的最高耐受NaCl含量分別為8%、9%。

圖6 乳酸菌axb74（A）與axb79（B）的鹽耐受性測定結果Fig.6 Determination results of salt tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

2.3.4 乳酸菌的SO2耐受性分析

圖7 乳酸菌axb74（A）與axb79（B）的SO2耐受性測定結果Fig.7 Determination results of SO2tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

由圖7可知，菌株axb74與axb79的生長速率隨著SO2質量濃度的增加而降低。菌株axb74、axb79在SO2質量濃度為80 mg/L的環境中生長速率均緩慢增加，但在SO2質量濃度為90 mg/L的環境中，菌株生長速率均無明顯提升，OD600nm值始終保持在0.02左右。因此，菌株axb74、axb79的最高耐受SO2質量濃度均為80 mg/L。

3 結論

從新疆不同品種釀酒葡萄表皮中分離篩選得到37株乳酸菌，經形態觀察將其初步分為4種類型，經分子生物學鑒定菌株axb79、axb80、axb81均為檸檬明串球菌（Leuconostoc citreum），菌株axb74為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）。

選取兩類乳酸菌菌株axb74和axb79進行耐受性分析，結果表明，菌株axb74最高耐受12%乙醇、pH 3.5、80 mg/L SO2、8%NaCl，菌株axb79最高耐受11%乙醇、pH3.0、80mg/L SO2、9%NaCl。對后續制作新疆特色葡萄酒的菌種進行初步的確定，從而進一步為改進本土乳酸菌、提升酒品質量提供依據。