堿法破壁-酶法提取葡萄酒廢酵母細胞壁多糖的工藝研究

石豪磊，趙國正，孔祥君，欒俊家，孔國光，牌延惠，張麗君，許維娜，2*

（1.濱州醫學院藥學院（葡萄酒學院），山東 煙臺 264003；2.煙臺張裕集團有限公司 山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東 煙臺 264001；3.煙臺邁百瑞國際生物醫藥有限公司，山東 煙臺 264006）

酵母泥作為葡萄酒生產的主要副產物之一，含量約占葡萄酒產量的4%～5%[1-2]，近幾年我國葡萄酒年產量均在10億L以上，隨之生成的廢酵母泥極為豐富。葡萄酒廢酵母中含有豐富的蛋白質、氨基酸、多糖、核酸、維生素、礦物質等成分，在食品、醫藥、化工、飼料等工業應用普遍[3-6]。對葡萄酒酵母泥進行開發利用，不僅有利于企業提高經濟效益，而且能防止環境污染，具有明顯的生態效益。

葡萄酒廢酵母細胞壁中含有豐富的多糖類物質，約占細胞干質量的25%～40%，主要成分是葡聚糖和甘露聚糖[2，7]。細胞壁多糖具有較高的生物性能，在人體的消化道中可作為膳食纖維發揮作用，并具有免疫調節、提高巨噬細胞活性、抗癌、抑制有害菌生長、促進有益菌繁殖等功能，加上酵母細胞壁多糖天然、安全、可靠，已作為抗生素替代品成為新的開發熱點[8-11]。

目前啤酒廢酵母的綜合利用研究較多[12-13]，葡萄酒廢酵母相關研究較少[14]。酵母多糖常用的提取技術有超聲波輔助提取法[15]、微波輔助提取法[16]、堿溶法[17]、酶法[18]、自溶法[19-20]等，其中超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取時間短，但其設備成本和能耗較高；堿溶法操作簡單、成本低，但提取時間過長、提取率低，且會造成一定的環境污染；酶法具有反應條件溫和、選擇性強、設備要求低等優點，但提取成本相對較高；自溶法成本低，但具有工藝過程復雜、提取率低等缺陷。

本研究以葡萄酒工業發酵產生的廢酵母泥為材料，過篩法除去葡萄果皮、果籽等雜質后，進行堿（KOH）法細胞破壁和酶法提取細胞壁多糖，以破壁液中蛋白質含量、多糖提取率為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗優化堿法破壁及酶法提取法多糖工藝條件，以期達到較高的多糖提取率，實現葡萄酒廢酵母的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒廢酵母泥：瑞楓奧賽斯（煙臺）葡萄酒莊園有限公司；KOH（分析純）、濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（純度≥98%）、木瓜蛋白酶（1000U/mg）、堿性蛋白酶（200U/mg）、中性蛋白酶（500U/mg）、蝸牛酶（破壁率＞90%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KS50R臺式高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；DC-01低溫恒溫水浴鍋：北京市華瑞科學器材有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；G6860型紫外分光光度計：美國安捷倫科技公司；Milli-Q AdvantageA10超純水系統：默克化工技術（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 廢酵母泥過篩處理

將葡萄酒酵母泥與蒸餾水按照料液比1∶1（g∶mL）混合均勻，平分為A、B、C、D四個樣品，分別過60、80、100、120目篩進行除雜篩分，葡萄果皮、果籽等雜質被篩網截留，酵母通過篩網后收集。以酵母泥的得率（OD600nm值）與過濾時間為考察指標，篩選合適的篩目。過篩處理連續進行2次，過篩酵母進行離心（4 000 r/min、20 min）處理。檢測標準：酵母泥下層沉淀為白色，上層液體無色透明，除雜后的酵母泥105℃烘干至恒質量。

1.3.2 堿法破壁處理

堿法進行酵母細胞破壁時，選用超聲波法進行輔助，超聲頻率采用80 kHz，功率500 W[2]。選擇KOH[17]質量濃度（40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L）、堿處理溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、堿處理時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）三個因素為變量進行單因素試驗，破壁液離心（13 000 r/min、20 min）后取上清，用考馬斯亮藍法測定粗蛋白含量，考察各因素對廢酵母破壁效率的影響。

堿法破壁工藝優化正交試驗的3個主要影響因素為：堿處理溫度（A）、堿質量濃度（B）、堿處理時間（C），依據單因素試驗結果每個因素選取3個水平，以破壁上清液中蛋白質含量為評價指標衡量破壁效果，通過正交試驗來優化破壁工藝條件。

1.3.3 酶法提取細胞壁多糖

破壁酵母液進行離心，沉淀按料水比1∶5（g∶mL）加磷酸鹽緩沖液，分別對生物酶種類（木瓜蛋白酶、蝸牛酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶）、加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、酶解時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）和酶解初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）進行單因素試驗。用苯酚-硫酸比色法[14]測定酶解液中的多糖含量，考察各影響因素對多糖提取效率的影響。

酶解法提取細胞壁多糖正交試驗的4個主要影響因素為：酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶添加量（C）及酶解初始pH值（D），依據單因素試驗結果每個因素選取3個水平，通過正交試驗來優化提取工藝條件，以獲得較高的多糖提取率。

1.3.4 分析檢測

蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法；多糖含量測定采用苯酚-硫酸比色法[14]，多糖提取率計算公式如下：

式中：C為上清液中多糖質量濃度，mg/L；V為上清液的總體積，L；m為酵母泥干質量，mg。

2 結果與分析

2.1 廢酵母泥過篩處理

由表1可知，從時間角度考慮，60目篩兩次過篩時間分別為10 s、10 s，用時最短；從酵母得率角度考慮，80目篩過篩后酵母得率最高，OD600nm為4.247。考慮到60目篩和80目篩的處理時間差別不大，選取80目篩為過篩除雜的最適目數。

表1 葡萄酒廢酵母的預處理條件與結果Table 1 Pretreatment conditions and results of spent yeast of wine

2.2 蛋白質含量測定

以牛血清白蛋白質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制牛血清白蛋白標準曲線如圖1所示。由圖1可知，牛血清白蛋白標準曲線回歸方程為y=0.0061x+0.0200；相關系數R2=0.999，表明二者線性關系良好。

圖1 牛血清白蛋白的標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.3 破壁工藝優化單因素試驗

2.3.1 堿質量濃度對廢酵母破壁的影響

由圖2可知，在堿處理溫度為60℃，處理時間為0.5h時，隨著堿質量濃度在40～70 g/L范圍內的增加，蛋白質含量由76.86 mg/L提高到148.05 mg/L，即廢酵母破壁效率不斷提高；當堿質量濃度為70 g/L時，蛋白質含量最高，破壁效率最好；當堿質量濃度＞70 g/L之后，廢酵母破壁效率快速下降。因此，最佳堿（KOH）質量濃度為70 g/L。

圖2 堿質量濃度對廢酵母破壁的影響Fig.2 Effects of alkali concentration on cell wall-breaking of spent yeast

2.3.2 堿處理溫度對廢酵母破壁的影響

由圖3可知，在堿質量濃度為70 g/L，處理時間為0.5 h時，隨著堿處理溫度由30～60℃范圍內的升高，蛋白質含量由52.86 mg/L提高到78.09 mg/L，即廢酵母的破壁效率不斷提高，堿處理溫度為60℃時，蛋白質含量最高，破壁效率最好；堿處理溫度＞60℃之后，蛋白質含量略有下降。因此，最佳堿處理溫度為60℃。

圖3 堿處理溫度對廢酵母破壁的影響Fig.3 Effects of treatment temperature of alkali on cell wall-breaking of spent yeast

2.3.3 堿處理時間對廢酵母破壁的影響

由圖4可知，在堿液質量濃度為70 g/L，堿處理溫度為60℃時，堿處理時間在0.5～1.0 h范圍內的升高，蛋白質含量由77.28 mg/L提高到91.24 mg/L，即廢酵母破壁效率有較大提高，堿處理時間為1.0 h時，蛋白質含量最高。堿處理時間＞1.0 h后，蛋白質含量略有下降，酵母破壁效率基本穩定。因此，最佳堿處理時間為1.0h。

圖4 堿處理時間對廢酵母破壁效率的影響Fig.4 Effect of treatment time of alkali on cell wall-breaking of spent yeast

2.4 堿法破壁工藝優化正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，選取堿處理溫度（A）、堿質量濃度（B）、堿處理時間（C）3個影響因素，以破壁上清液中蛋白質含量為評價指標，通過正交試驗優化破壁工藝條件，結果與分析見表2。由表2可知，3個因素對破壁效率的影響由大到小排序為堿質量濃度＞處理溫度＞處理時間。最佳破壁工藝條件組合為A2B2C3，即堿處理溫度60℃，堿液質量濃度70 g/L，破壁時間1.5 h。在此最佳破壁工藝條件下進行3次驗證試驗，得到的蛋白質含量為163.21 mg/L。

表2 廢酵母破壁工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for technology optimization of cell wall-breaking of spent yeast

2.5 多糖含量標準曲線

以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線如圖5所示。由圖5可知，葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.0274x+0.0013；相關系數R2=0.998，表明二者線性關系良好。

圖5 葡萄糖標準曲線Fig.5 Standard curve of glucose

2.6 酶法提取細胞壁多糖工藝優化

2.6.1 酶種類對多糖提取率的影響

由圖6可知，在酶添加量為0.2%，pH值為6.0，溫度50℃，酶解時間1.0 h的條件下，采用中性蛋白酶的多糖提取率最高，為19.56%。因此，確定最適酶為中性蛋白酶。

圖6 酶的種類對酵母多糖提取率的影響Fig.6 Effect of enzyme types on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.2 酶解時間對多糖提取率的影響

由圖7可知，在酶添加量為0.2%，pH值為6.0，酶解溫度為50℃的條件下，酶解時間在0.5～1.5 h范圍內，多糖提取率由12.52%逐漸增加到19.69%；酶解時間為1.5 h時，達到最高多糖提取率；酶解時間＞1.5 h之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解時間為1.5 h。

圖7 中性蛋白酶的酶解時間對酵母多糖提取率的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time of neutral protease on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.3 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖8可知，在酶添加量為0.2%，pH值為6.0，酶解時間為1.0 h的條件下，酶解溫度在30～50℃范圍內，多糖提取率由13.51%增加到19.53%；酶解溫度為50℃時，多糖提取率最高；酶解溫度＞50℃之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解溫度為50℃。

圖8 中性蛋白酶的酶解溫度對酵母多糖提取率的影響Fig.8 Effect of enzymatic hydrolysis temperature of neutral protease on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.4 酶添加量對多糖提取率的影響

由圖9可知，在酶處理pH為6.0，酶解時間1.0 h，酶處理溫度50℃的條件下，酶添加量在0.1%～0.3%范圍內，多糖提取率由16.75%增加到20.16%；酶添加量為0.3%時，多糖提取率最高；酶添加量＞0.3%之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶添加量為0.3%。

圖9 中性蛋白酶添加量對酵母多糖提取率的影響Fig.9 Effect of neutral protease addition on extraction rate of yeast polysaccharides

2.6.5 初始pH值對多糖提取率的影響

由圖10可知，在酶添加量為0.2%，酶處理溫度為50℃，酶處理時間為1.0 h的條件下，初始pH值在4.0～6.0范圍內，多糖提取率由13.35%增加到19.15%；初始pH值為6.0時，多糖提取率達到最大；初始pH值＞6.0之后，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解初始pH值為6.0。

圖10 中性蛋白酶的酶解pH對酵母多糖提取率的影響Fig.10 Effect of enzymatic hydrolysis pH of neutral protease on extraction rate of yeast polysaccharides

2.7 酶法提取細胞壁多糖工藝優化正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，選取酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶添加量（C）及酶解初始pH值（D）4個影響因素，以多糖提取率為評價指標，通過正交試驗優化多糖提取工藝條件，結果與分析見表3。

表3 酶法提取多糖工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme extraction technology optimization of polysaccharides

由表3可知，4個影響因素對多糖提取率的影響由高到低順序為酶解溫度＞酶添加量＞酶解pH值＞酶解時間。最佳多糖提取工藝條件組合為A2B2C2D3，即酶解溫度50℃，酶解時間1.5 h，酶添加量0.3%，初始pH值7.0。在此條件下進行3次驗證試驗，得到的多糖提取率為21.08%。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗對除雜條件、超聲輔助-堿法破壁-酶法提取細胞壁多糖的工藝進行探索，確定的最佳破壁工藝條件為：80目篩過篩除雜；細胞破壁采用70 g/L KOH，60℃下處理1.5 h，80 kHz超聲輔助；酶法提取多糖選用中性蛋白酶，最佳提取工藝條件為酶添加量0.3%，酶解溫度50℃，酶解時間1.5 h，初始pH值為7.0；酵母細胞壁多糖提取率可達21.08%。研究結果證明，超聲輔助-堿-酶復合方法用于酵母細胞破壁和細胞壁多糖提取時，多糖得率較單一方法更高，工業化前景更廣闊。本研究結果可為葡萄酒廢酵母附加價值的開發利用提供技術參考。