揚州醬菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選、鑒定及性能研究

丁娟芳，楊 嘉，朱淑云，李文潔，韋林洪*

（1.揚州市職業大學 生物與化工工程學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州市產品質量監督檢驗所，江蘇 揚州 225111）

亞硝酸鹽在食品中廣泛存在，在蔬菜制品中則更為普遍。蔬菜中的亞硝酸鹽主要由細菌將植物體內的硝酸鹽轉化而來，高含量的亞硝酸鹽進入人體后會導致一系列的健康風險[1-4]。

乳酸菌是食品自然發酵中的常見菌種之一，通常被認為是安全的益生菌[5-6]。相關研究表明，乳酸菌在生長代謝過程中可以降解亞硝酸鹽，從而保證食品安全[7-10]，故從自然發酵環境中分離乳酸菌并對其進行研究成為一種趨勢[11]。已報道的亞硝酸鹽降解乳酸菌有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串球菌（Leuconostoc mesenteulides）、啤酒片球菌（Pediococcus cerevisiae）、乳酸糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）等[12]，其降解原理主要體現于代謝過程中產生的乳酸和一系列酶，以及乳酸菌成為優勢菌后對其他產亞硝酸鹽雜菌的生長抑制[11]。目前，對于乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究主要集中于產酸和亞硝酸鹽還原酶，而降解機制、基因組學還有待進一步研究，其應用離工業化生產也還有一定距離[13]。

揚州醬菜素享盛名，擁有著2 100年的悠久歷史，其生產工藝融合了制醬、腌漬等過程，千百年來既有傳承，也有創新[14]。本研究旨在從揚州傳統醬菜中篩選出具有降解亞硝酸鹽活性的優良乳酸菌，采用形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定并研究其性能，為今后進一步研究其降解機理并建立發酵體系提供良好的菌種資源和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬菜樣品：均為揚州市場銷售的本地散裝醬菜。

1.1.2 培養基

MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、生化鑒定管：廣東環凱微生物科技有限公司。

乳酸菌篩選培養基：在MRS瓊脂培養基中添加質量濃度為0.2 g/L的碳酸鈣；

亞硝酸根降解篩選培養基：在MRS肉湯培養基中添加質量濃度為100 mg/L的NO2-。

1.1.3 試劑

革蘭氏染色試劑盒：廣東環凱微生物科技有限公司；KOD FX脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（1.0 U/μL）：日本TOYOBO公司；DNA凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒：美國Axygen公司；碳酸鈣、氫氧化鉀、乙酸、甘油、雙氧水（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸根（NO2-）標準溶液（1 000 μg/mL）、硝酸根（NO3-）標準溶液（1 000 μg/mL）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HVE-50滅菌鍋：日本Hirayama公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；YQX-II厭氧培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；ICS1500離子色譜（ion chromatography，IC）儀：美國戴安公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ECLIPSE生物顯微鏡：日本尼康公司；3-30k冷凍臺式高速離心機：德國Sigma公司；752型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；2720PCR擴增儀：美國ABI公司；DYY-8C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；E1617-T130 plus凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Bagmixer400拍擊式均質器：法國Interscience公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

稱取25 g醬菜樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min，制成10-1樣品均液。吸取1 mL 10-1樣品均液注入盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，混合均勻得到10-2樣品均液。重復以上操作制成10-3樣品均液。吸取不同濃度樣品勻液1 mL涂布于無菌平皿內，將冷卻至46℃的乳酸菌篩選培養基傾注平皿，混合均勻后置于（36±1）℃培養箱中培養48 h，直到有溶鈣圈的單菌落出現。單菌落經純化后進行革蘭氏染色，革蘭氏陽性同時觸酶陰性[15-16]的菌株由保藏珠吸附后加入含50%甘油的MRS肉湯介質中，于-70℃超低溫冰箱中進行保存。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

將活化2代的待測菌株接種于MRS肉湯培養基中，于（36±1）℃條件下培養24h。培養液在無菌條件下2000r/min離心10min，棄去上清液，用10mL生理鹽水振蕩洗滌菌體。重復以上離心、棄上清、洗滌菌體操作2次，在洗滌后的菌體中加10 mL生理鹽水混勻，制成測試菌液。以生理鹽水作為對照，采用分光光度計在波長550 nm處測定測試菌液的光密度OD550nm值，控制其在0.6～0.8范圍內。

將測試菌液以5%（V/V）的接種量接種到10 mL亞硝酸根（NO2-）降解篩選培養基中，于（36±1）℃條件下靜置培養24 h。檢測培養基中的NO2-含量，用降解率來表示菌株降解NO2-的能力，以篩選出有高降解活性的乳酸菌菌株。NO2-含量測定方法參考GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行測定。NO2-降解率的計算公式如下：

1.3.3 菌種鑒定

（1）形態觀察和生理生化鑒定

將1.3.2中篩選到的具有降解鹽酸鹽活性的乳酸菌活化2代后接種至MRS瓊脂培養基中，培養24 h后，對菌株進行形態觀察。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》對乳酸菌進行生理生化特性鑒定[15-16]，碳源利用試驗采用生化鑒定管進行。

（2）分子生物學鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取菌株的基因組[17]，以通用引物對（27f/1492r）對菌株的16SrDNA序列進行擴增。PCR擴增反應體系：2×KOD Buffer 25μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture 10 μL、KOD DNA polymerase 1 μL、引物27f和1492r各1.5 μL、雙蒸水（ddH2O）10 μL、模板1 μL。PCR擴增程序：94 ℃、3 min；98 ℃、10 s，55 ℃、30 s，68 ℃、4 min，30個循環；68 ℃、2 min。PCR擴增產物經純化后進行測序。引物及測序結果均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

將菌株的測序結果與美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中的GenBank數據庫進行BLAST比對搜索，選擇近源菌種的16S rDNA序列用Clustal X進行序列比對，最后采用MEGA 6.06軟件中的鄰接法（neighbour-joining，NJ）構建系統發育樹，分析鑒定菌株與已知菌株的同源性。

1.3.4 生長性能的測定

（1）培養溫度對菌株生長的影響

將1.3.2中的測試菌液按5%（V/V）接種量接種至10 mL MRS液體培養基中，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃溫度條件下靜置培養48h，以無菌培養基為空白，在波長550 nm處測定吸光度值。

（2）菌株生長曲線的測定

將1.3.2中的測試菌液按5%（V/V）接種量接種至MRS液體培養基中，以最適生長溫度培養24 h，每隔3 h取樣，以無菌培養基為空白，測定樣品在波長550 nm處的吸光度值，以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制測試菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

從醬菜樣品中共分離出有溶鈣圈的菌株59株，其中觸酶試驗陰性同時革蘭氏染色陽性的菌株共32株，初步鑒定為乳酸菌[15-16]。將分離出來的菌株接種到含的MRS肉湯培養基中，培養后用離子色譜檢測培養基中的含量并計算其降解率，結果如表1所示。

由圖1可以看出，取培養12h的菌株DGJ-17的培養液進行分析，在標準物質的保留時間出現了對應的色譜峰，推測在培養過程中有的產生。張慶芳等[18]的研究表明，在發酵初期，發酵液pH值為4.5～6.5時，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解主要是由于乳酸菌產生亞硝酸鹽還原酶進行的酶降解；而在pH值＜4.0之前，亞硝酸鹽的降解主要是由于乳酸菌代謝產酸，通過化學反應將轉變為NO3-[19]，這也可能是DGJ-17培養液中出現的原因。

表1 乳酸菌培養24 h后NO2-降解率Table 1 Degradation rate of NO2-by lactic acid bacteria cultured for 24 h

圖1 NO2-及NO3-的檢測離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of NO2-and NO3-analysis

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態特征

菌株DGJ-17在MRS瓊脂培養基上的菌落及細胞形態結果見圖2。

圖2 菌株DGJ-17在MRS瓊脂培養基上的菌落形態（A）和細胞形態（B）Fig.2 Colonial(A)and cell(B)morphology of strain DGJ-17 on MRS agar medium

由圖2A可以看出，菌株DGJ-17在MRS瓊脂培養基上菌落為乳白色球形，表面光滑、邊緣整齊、中央凸起，菌落直徑多為0.2～0.8mm。由圖2B可知，菌株為革蘭氏陽性菌，油鏡下細胞呈現圓球形，單細胞直徑為0.8～1.3 μm，多數成對，部分呈單個或短鏈狀。

2.2.2 生理生化鑒定

將菌株DGJ-17活化后接種于MRS瓊脂培養基上，經24 h厭氧培養后發現菌株生長良好，由此說明該菌為兼性厭氧菌。菌株DGJ-17的生理生化試驗結果見表2。

由表2可知，菌株DGJ-17在10℃、45℃和6.5%NaCl條件下均可以正常生長，發酵葡萄糖產酸不產氣。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》并結合菌株DGJ-17的形態及生理生化特性可初步確定菌株DGJ-17為腸球菌屬（Enterococcus）。

表2 菌株DGJ-17的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DGJ-17

2.2.3 分子生物學鑒定

將菌株DGJ-17的16SrDNA序列結果在NCBI進行Blast相似性比對，選取同源性較高的腸球菌屬乳酸菌，以鄰接法構建系統發育樹，結果見圖3。

圖3 菌株DGJ-17的16S rDNA序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain DGJ-17 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株DGJ-17與乳酸腸球菌（Enterococcus lactis）聚于一支，親緣關系最近，同源性達到99%。結合該菌株形態特點和生理生化特征，將菌株DGJ-17鑒定為乳酸腸球菌（Enterococcus lactis）。

2.3 生長性能測定結果

2.3.1 培養溫度對菌株DGJ-17生長的影響

測定不同培養溫度下菌株DGJ-17的生長情況，結果如圖4所示。

圖4 不同培養溫度對菌株DGJ-17生長的影響Fig.4 Effect of different culture temperature on growth of strainDGJ-17

由圖4可知，菌株DGJ-17在15～45℃的溫度范圍內均能生長，30℃培養時，菌體密度達到最高（OD550nm=1.4），故30℃為菌株的最適生長溫度。

2.3.2 菌株DGJ-17的生長曲線

菌株DGJ-17在30℃培養條件的生長曲線見圖5。

圖5 30℃條件下菌株DGJ-17的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain DGJ-17 at 30℃

由圖5可以看出，菌株DGJ-17的生長遲緩期為0～12 h，對數生長期為12～30h，平穩期為30～48h，菌體在培養48h后逐步進入衰退期。

3 結論

本實驗從揚州醬菜中篩選到一株能降解亞硝酸鹽的高活性乳酸菌DGJ-17，其NO2-降解率為91.7%，菌株經形態學、生理生化和16S rDNA序列分析被鑒定為乳酸腸球菌（Enterococcuslactis）。菌株DGJ-17的最適生長溫度為30℃，生長遲緩期、對數期、平穩期分別為0～12 h、12～30 h、30～48 h，培養48 h后逐步進入衰退期。本實驗對乳酸腸球菌DGJ-17的后期應用提供了一定的理論依據，其降解機理及在食品領域的應用還有待進一步研究。