木糖濃度及補料發酵對樹干畢赤酵母乙醇發酵的影響

吳仁智，陳 東，黃 俊，陸 琦，蘆志龍，陳 英，陳小玲，黃日波*

（1.廣西科學院國家非糧生物質能源工程技術研究中心 非糧生物質酶解國家重點實驗室 廣西生物質產業化工程院廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學 生命科學與技術學院 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

木糖是自然界中第二豐富多聚糖—半纖維素的主要降解產物[1-2]，若能利用其轉化為燃料乙醇，意義重大。目前已知能利用木糖發酵生產乙醇的較為優良的酵母菌種有管囊酵母（Pachysolen tannophilus）[3-4]、樹干畢赤酵母（Pichia stipits）[5]和休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）[6-7]等。而以樹干畢赤酵母利用木糖發酵產乙醇的能力最強[5，8]。為此，筆者曾以樹干畢赤酵母CICC1960作為原始菌株，通過60Co誘變，選育出一株較為優良的突變菌株1K-9[9]。而為實現菌株高濃度酒精發酵，需進行高濃度糖（底物）發酵。實際上，在酵母酒精發酵過程中，底物濃度會對酵母發酵的結果產生很大的影響。若底物濃度過低，則會被酵母細胞迅速耗盡，底物供應的不足會造成酵母細胞過早地從指數生長期向平衡期轉變，發酵提前結束，乙醇濃度不高；反之，高濃度底物帶來高滲透壓，產生底物抑制作用，從而影響酵母細胞生長，生物量不足，影響發酵的進行，造成乙醇產量也不高。

補料發酵（fedbatchfermentation）對于解決底物不足以及實現高濃度酒精發酵等均具有重要的意義。其一般先在一定濃度的底物下進行發酵，經過一定時期，消耗了一部分底物后，再補加一定濃度的底物繼續進行發酵，最終獲得高濃度的目標產物。1987年補料發酵就應用在支鏈淀粉（pullulan）生產上，能解決高濃度底物對細胞生長的問題從而提高支鏈淀粉的產量[10]。除此之外，補料發酵已成功應用在丙酮-丁醇-乙醇發酵[11]、纖維素酶[12]、谷氨酰胺轉移酶[13]、木糖醇[14]、2,3-丁二醇[15]等的生產。不論是實驗室規模[16]，還是工業化生產[17]，采用補料發酵對于酒精發酵來說，效果均較為理想。鑒于此，本實驗首先第一輪發酵分別進行不同濃度木糖對菌株1K-9乙醇發酵的影響試驗，確定出一個對此菌株生長、發酵較為理想的木糖濃度，然后第二輪進行補料發酵：采用含有上述較為理想濃度的木糖培養基進行酒精發酵，一段時間后進行補料發酵，考察酒精發酵的酒度等一系列參數，然后進行比較，從而確定補料發酵是否有效，即通過探究不同濃度木糖以及補料發酵對優良菌株1K-9發酵木糖產乙醇的影響，旨在提高木糖乙醇發酵水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

木糖（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國OXOID公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）、四水合酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、偏重亞硫酸鈉、乙腈（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌種

樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）1K-9菌株：本實驗室保存，由購買自中國工業微生物菌種保藏中心的Pichia stipitis CICC 1960菌株經60Co誘變選育[9]，其醪液酒精濃度比原始菌株的提高了10.05%。

1.1.3 培養基

酵母浸粉木糖（yeast peptone xylose，YPX）培養基：木糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，121℃滅菌20 min，自然pH，固體培養基添加2%的瓊脂。

發酵培養基：分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%木糖培養基。

1.2 儀器與設備

6890N氣相色譜儀：美國安捷倫儀器公司；ECLIPSE80i顯微鏡（熒光）：日本尼康儀器有限公司；DU800分光光度計：美國貝克曼庫爾特有限公司；320R臺式超速離心機：德國赫提馳儀器有限公司；ZWY-240搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將甘油或斜面保存的菌株在實驗前接種于YPX培養基，30℃、180 r/min培養過夜，轉接2次，同條件下培養菌數至2×108個/mL，4 ℃條件下保存，2 d內使用。

1.3.2 不同濃度木糖對酵母乙醇發酵的影響

活化的菌株接種至不同木糖含量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）的發酵培養基，初始菌數2×108個/mL，裝液量100mL/250mL，30℃、130r/min進行乙醇發酵，定時取樣檢測乙醇含量、殘留木糖含量、菌數等指標。

1.3.3 補料發酵

同1.3.2，但先采用10%木糖培養基進行木糖乙醇發酵：裝液量50 mL/250 mL，30℃、130 r/min發酵36 h時補加等體積20%木糖培養基繼續發酵，定時取樣檢測乙醇含量、殘留木糖含量、菌數等指標。

1.3.4 測定方法

菌數測定：取發酵醪液，即時進行菌數測定：樣品根據情況適當稀釋，利用血球計數板計數[18]。

乙醇含量測定：用氣相色譜法測定乙醇含量，乙腈作為內標，參照文獻[16]的方法。

木糖含量測定：取培養基或發酵液12 000 r/min離心5 min，吸取100 μL上清或上清的稀釋液后用3,5-二硝基水楊酸法測定，具體綜合參照美國能源部的方法[19]和GHOSE T K等[20]方法進行（測定吸光值OD520nm）。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基木糖含量對菌株生長、乙醇產量及木糖利用情況的影響

酵母菌株生長需要一定的培養條件，當糖濃度低時，酵母細胞會快速利用完糖，而當糖濃度過高，其面臨的滲透壓會增高，會抑制酵母細胞的生長。為此，分別采用了含有不同濃度木糖的培養基對菌株1K-9進行生長及產乙醇情況的比較，目的是為了考察不同濃度木糖對菌株1K-9生長及產乙醇的影響，結果見圖1。

由圖1a可知，當培養基木糖含量為5%～10%時，木糖含量的增加有利于酵母的生長，且能快速促進酵母的生長。木糖含量較低（5%）時，菌數增長比較緩慢，36 h、48 h、60 h菌數分別為（6.29±0.55）×108個/mL、（8.62±1.76）×108個/mL和（9.97±0.44）×108個/mL。隨著木糖含量的增加，能快速促進酵母的生長，采用10%木糖培養基培養，36 h時菌數為（13.62±1.60）×108個/mL，且能長時間維持在高菌數狀態（36～60 h），這對于酵母酒精發酵非常有利。但當木糖含量＞10%時，會表現出一定的抑制作用。采用15%木糖培養基培養，36 h時菌數為（11.79±3.05）×108個/mL，比10%木糖培養基低。當培養基木糖含量＞15%時，菌株增殖速度較低濃度時變緩，20%木糖培養基培養36 h時菌數僅為（7.57±0.62）×108個/mL，需要培養至84 h時菌數才達到最大值（13.88±0.13）×108個/mL。當木糖含量＞20%時，菌株的生長明顯受到抑制，且隨著木糖含量的增高抑制更明顯，木糖含量25%和30%培養36h時菌數分別只有（6.77±1.43）×108個/mL和（3.21±0.10）×108個/mL。因此，最有利于高產菌株1K-9生長的培養基木糖含量為10%。

由圖1b可知，5%、10%和15%木糖培養基醪液的乙醇含量分別于發酵36h、48h、108h達到最大值（2.56±0.03）%vol、（4.71±0.05）%vol和（6.20±0.13）%vol。而10%木糖培養基相對于其他5種培養基，酵母最能迅速發酵生成乙醇。培養基木糖含量為20%時，培養108h醪液的乙醇含量為（4.24±0.04）%；培養基木糖含量為25%和30%時，發酵醪液的乙醇含量較低，最高值分別為（1.81±0.03）%和（0.79±0.07）%。

由圖1c可知，5%木糖培養基發酵36 h時醪液中殘留木糖為（15.72±0.23）g/L，72 h利用完木糖；10%木糖培養基發酵72 h時醪液中殘留木糖為（4.03±0.03）g/L，84 h利用完木糖；15%木糖培養基發酵108 h時醪液中殘留木糖為（4.73±0.62）g/L；而含高濃度糖的培養基，20%、25%、30%木糖培養基發酵132 h醪液中殘留木糖仍很高，分別為（48.93±1.16）g/L、（158.66±1.21）g/L和（209.47±0.43）g/L，后兩種有大量的糖殘留。利用低濃度木糖發酵，菌株能快速代謝木糖，而高濃度糖發酵，菌株受到一定的抑制造成大量的木糖殘留。酒精發酵一般要求達到一定的酒度（酒度太低，能耗高，一般采用高濃度乙醇發酵）且殘留糖含量越低越好。

圖1 發酵培養基中木糖含量對菌株1K-9生長（a）、乙醇產量（b）及木糖利用情況（c）的影響Fig.1 Effect of xylose concentration on growth(a),ethanol production(b)and xylose utilization(c)of strain 1K-9 in fermentation medium

綜合分析可知，10%木糖濃度酵母能迅速生長且能維持高菌數的時間較長（36～60 h）、最能迅速發酵生成乙醇。因此，最有利于菌株1K-9發酵的培養基木糖含量為10%。

2.2 補料發酵

10%木糖培養基培養36 h時酵母能迅速生長至一較高的菌數值。為此，菌株1K-9先采用10%木糖進行乙醇發酵，即菌株經活化3次后，種子液以10%接種量、50 mL10%木糖培養基，發酵36 h補加等體積的20%木糖培養基繼續發酵，整個發酵過程菌數變化、醪液乙醇產量和殘糖含量見圖2。

圖2 補料發酵過程中菌株1K-9生長、乙醇產量及木糖利用情況Fig.2 Growth,ethanol production and xylose utilization of strain 1K-9 during fed-batch fermentation

由圖2可知，補料發酵60 h時，菌數含量達到最高值（12.62±0.27）×108個/mL，其后續的發酵菌數仍能保持較高菌數，發酵至108h時菌數也達到了（12.16±0.07）×108個/mL，較未補料發酵時有所提高；發酵108 h時醪液中殘留的木糖含量為（1.03±0.02）g/L較未補料發酵時有所降低；乙醇含量達到了6.56%vol，較未補料時提高了1.85%vol。因此，采用10%木糖培養基發酵36 h后立即添加20%木糖培養基進行補料繼續發酵，是十分有效的。

3 討論

補料發酵過程一般先采用低濃度底物進行發酵，一定時期補加相應濃度底物繼續發酵，既能解決菌種生長的問題，又能解決底物富足進行發酵從而達到研究者們所期望的目標產物濃度的問題，已經廣泛應用在發酵領域，并成功實現了諸多發酵產物的工業化生產。不論是實驗室規模[16]，還是工業化生產[17]，采用補料發酵對于酒精發酵來說，效果均較為理想。曾開展了糖蜜乙醇發酵，先采用20°Bx糖蜜培養酵母菌數至2×108個/mL后，補加等體積高糖度糖蜜（55 °Bx）繼續發酵[16]，效果顯著。此外，甘蔗糖蜜酒精高產酵母菌株MF1001實行高濃發酵生產試驗也是類似的方法，采用低濃度罐發酵待菌數繁殖至一定濃度（一般是2×108個/mL左右）后，再混合高濃度罐發酵，也就是低高濃度糖蜜罐混合發酵[17]。

4 結論

菌株1K-9先采用10%木糖培養基進行乙醇發酵，36h補加等體積的20%木糖培養基繼續發酵，發酵至108 h時菌數達到了（12.16±0.07）×108個/mL，較未補料發酵時有所提高；發酵108h時醪液中殘留的木糖含量為（1.03±0.02）g/L，較未補料發酵時有所降低；乙醇含量達到了6.56%vol，較未補料時提高了1.85%vol。為此，補料發酵是有效的。