全因子試驗設計優化產ACE抑制肽羊乳發酵工藝及其冷藏研究

陳 合，李儀琳*，張博文，王 媛

（陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

高血壓已成為當今危害人類健康的高發病癥，在我國高血壓患病率仍保持增長趨勢[1]，且近幾年的高血壓患病人群趨于低齡化。目前，傳統的降壓藥雖具有抗高血壓作用，但同時也具有一些副作用[2]。因此，人們逐漸趨向于選擇安全性高，可靠的生物抑制肽[3]，而血管緊張素轉換酶（angiotensinconveningenzyme，ACE）抑制肽則是一個成功的商業化應用案例[4]。ACE是一種與膜結合的含Zn2+和Cl-的羧肽酶，主要存在于哺乳動物的血漿及組織中。在腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）中，血管緊張素原在腎素的作用下形成無活性的血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在ACE的轉化作用下形成可促進血管收縮并導致血壓升高的血管緊張素Ⅱ；在激肽釋放酶-激肽系統（kallikrein-kinin system，KKS）中，激肽原在激肽釋放酶的作用下形成可使血管舒張的舒緩激肽，舒緩激肽可促進血管舒張，進而使得血壓降低。而ACE可使舒緩激肽失活，從而抑制其降壓作用[5-8]。因此，ACE活性的抑制可有效避免高血壓的發生。而ACE抑制肽（降壓肽）能有效抑制ACE活性，進而抑制RAS中的血壓升高效應和促進KKS中的血壓降低效應，最終起到降低高血壓的作用[9-10]。并且ACE抑制肽和其他降壓藥物相比，具有安全性高、無副作用、分子質量低、實用等優點[11]。

ACE抑制肽的制備方法有直接提取、化學合成、微生物發酵和酶解法。產生ACE抑制肽的主要方法是乳制品的微生物發酵。近年來，已發現多種益生菌用于發酵ACE抑制肽。GOBBETTI M等[12]使用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）SS1和乳脂乳桿菌（L.lactissubsp.cremoris）FT4混合制備ACE抑制肽；NIELSEN M S等[13-14]研究發現，兩株瑞士乳桿菌（L.helveticus）的發酵產物具有很強的ACE抑制活性，當pH值從4.6降至4.3時，ACE抑制活性增加，并且冷藏可以顯著增加ACE抑制活性。

課題組在前期篩選出一株在發酵羊乳中產ACE抑制肽能力強的保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）LB6基礎上[15]，本研究以山羊乳為原料，產ACE抑制肽菌株保加利亞乳桿菌LB6和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）ST為發酵菌株，采用全因子試驗設計對其在發酵羊乳中產ACE抑制肽的發酵工藝條件進行優化，并研究冷藏對發酵羊乳理化性質及質構的影響，以提高發酵羊乳中ACE抑制肽的含量，為后續開發含降壓肽的酸羊乳提供技術支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）LB6、嗜熱乳鏈球菌（S.thermophilus）ST：陜西科技大學食品與生物工程學院。

1.1.2 試劑

全脂羊奶粉：陜西紅星乳業有限公司；酵母浸粉：北京奧博星生物技術公司；血管緊張素轉換酶（ACE）（0.1U/mL）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基、M17培養基：青島希望生物科技有限公司；復水后的肉湯121℃滅菌15 min，冷卻后用于培養益生菌。

1.2 儀器與設備

YX-280D型手提式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備廠；DH5000AB型電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型酸度計：上海精科儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱：日本SANYO公司；TA.XT型物性測試儀：英國Stable Micro System公司；UV-5300PC型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；Q2-901型旋渦混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TG16A-WS型臺式高速離心機：湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將保加利亞乳桿菌LB6的凍干菌粉接種至MRS培養基中，嗜熱乳鏈球菌ST的凍干菌粉接種至M17培養基中[16]，于37℃條件下24h培養活化3代，使種子液中菌體濃度均為1×1011CFU/mL，備用。

1.3.2 發酵乳的制備

在無菌操作條件下，按5%（V/V）的接種量將活化后的保加利亞乳桿菌LB6和嗜熱鏈乳球菌ST接種至固形物含量為14%的無菌復原全脂羊乳中，37℃培養12 h至凝乳，并保存于冰箱4℃備用。

1.3.3 全因子試驗設計

表1 羊乳發酵條件優化全因子試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of full factorial experiments for optimization of goat milk fermentation conditions

1.3.4 冷藏對發酵羊乳理化性質及質構的影響

采用最優發酵工藝參數制備發酵羊乳，同批次制作樣品6份，于4℃冷藏，分別于0d（即發酵結束時）、3d、7d、14d、21 d和28 d時隨機取樣，測定其pH值、酸度、活菌數、ACE抑制率和質構的變化情況，并對其進行感官評價，重復3次測量。

1.3.5 測定方法

ACE抑制率的測定：采用文獻[12-13]的方法測定。

活菌數的測定：取已活化的益生菌ST和LB6按5%（V/V）的接種量接種至濃度為14%的復原全脂羊乳中，于37℃發酵培養24 h，每隔2 h取樣測定OD600nm值。

酸度的測定：采用氫氧化鈉滴定法[17]，以吉爾涅爾度（°T）表示。

pH值的測定：采用pHs-3c酸度計在室溫條件下直接測定。

感官評價：由5位及以上感官正常人員經培訓后品嘗，描述產品的表層外觀、組織狀態、口感、滋氣味、乳清析出等感官性狀。評分標準見文獻[18]，滿分為10分。

斷路器垂直連桿與連桿軸套密封件之間存在機械磨損，是造成斷路器合閘時間、合閘不同期時間嚴重超標和合閘速度偏低的直接原因。而造成斷路器垂直連桿與軸套密封件磨損的根本原因可能存在以下3個方面：

質構分析[19-21]：試驗選用TA.XT型物性測試儀進行測定，A/BE探頭的壓力盤直徑為40 mm。測定參數：測前運行速度與測試速度為1.0 mm/s、測后速度為10.0 mm/s；測試深度30.0 mm；感應力：Auto-1.0 g；記錄速率：400 pps。每種樣品重復測定3次。測定的指標有：硬度、稠度、凝聚性和黏度。

1.3.6 統計分析

羊乳生產條件的優化采用JMP10Pro（SASJMPStatistical10）軟件進行全因子試驗分析，影響因子的確定采用方差分析法。

2 結果與分析

2.1 混菌發酵羊乳生產條件優化的全因子試驗

對菌株LB6和ST混合發酵生產發酵羊乳的條件進行優化，發酵羊乳的ACE抑制率、活菌數及感官評分測定結果見表2。

表2 羊乳發酵條件優化全因子試驗設計及結果Table 2 Design and results of full factorial experiments for goat milk fermentation conditions optimization

采用JMP10 Pro軟件對表2中的數據結果進行分析，得到ACE抑制率、活菌數以及感官評分的方差分析。

2.1.1 ACE抑制率的方差分析

對混菌發酵羊乳ACE抑制率進行方差分析，結果見表3。

表3 發酵羊乳ACE抑制率的全因子試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of full factorial experiments results for ACE inhibition rate of fermented goat milk

由表3可知，菌株LB6和ST混菌發酵羊乳ACE抑制率的方差分析模型（P＜0.05）顯著，各因素對ACE抑制率無顯著影響（P＞0.05），影響順序為B＞AB＞A＞BC＞C＞AC。

2.1.2 活菌數的方差分析

對混菌發酵羊乳的活菌數進行方差分析，結果見表4。

由表4可知，菌株LB6和ST混菌發酵羊乳活菌數的主要影響因素為發酵時間和菌株比例，其他因素無顯著影響（P＞0.05）。各因素對活菌數的影響順序為C＞A＞AC＞B＞BC＞AB。

表4 發酵羊乳活菌數的全因子試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of full factorial experiments results for viable counts of fermented goat milk

2.1.3 感官評價的方差分析

對混菌發酵羊乳的感官評價進行方差分析，結果見表5。

表5 發酵羊乳感官評價的全因子試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of full factorial experiments results for sensory evaluation of fermented goat milk

由表5可知，菌株LB6及ST發酵羊乳感官評價的主要影響因素為發酵溫度與發酵時間的交互項（P＜0.01），其他項無顯著性影響（P＞0.05）。影響順序為BC＞C＞B＞AC＞AB＞A。

2.1.4 菌株LB6和ST混合發酵羊乳發酵條件的優化

發酵羊乳發酵條件的全因子試驗優化結果如圖1所示。

圖1 羊乳發酵條件的主因子優化圖Fig.1 Optimization of main factors for fermentation conditions of goat milk

由圖1可知，根據預測刻畫器，兼顧各項指標（ACE抑制率＞80%，活菌數和感官評價越大越好）得出，發酵羊乳的最優發酵工藝條件為菌株比例1∶1，發酵溫度為42℃，發酵時間為3.5h。在此條件下，其ACE抑制率預測值為84.56%，活菌數OD600nm值為0.28，感官評價為7.29分。

對上述最佳條件進行驗證試驗，得其ACE抑制率、活菌數OD600nm值、感官評分分別為（78.37±0.53）%、0.22±0.01、（7.35±0.25）分，其中活菌數與預測值0.28相差較遠，分析原因可能是活菌數受多種因素影響。其余項指標與預測值比較接近。

2.2 冷藏過程對混菌發酵羊乳的影響

2.2.1 冷藏過程中混菌發酵羊乳pH值、酸度和活菌數的變化

冷藏過程中，混菌發酵羊乳的pH值、酸度和活菌數測定結果見圖2。

圖2 冷藏過程中混菌發酵羊乳pH值、酸度和活菌數的變化Fig.2 Changes of pH value,acidity and viable counts of fermented goat milk by mixed fermentation during refrigeration

發酵羊乳中的活菌數會受多種因素影響，如冷藏溫度、pH值和酸度以及各種菌種之間的作用等[22]，由圖2可知，發酵羊乳的pH值隨著冷藏時間的延長而降低。隨著發酵時間的延長，樣品冷藏0～7 d，pH值降低較慢，只下降了0.1（3.94～3.84）；但冷藏7～14 d下降速度變快，pH值降低0.6（3.84～3.24）；冷藏14 d后酸化速度變緩，在14～28 d內，pH值僅降低了0.1（3.24～3.14），由此可知，冷藏7～14 d是酸化發生的主要時期。

酸度基本與其pH值相對應，發酵羊乳的酸度隨著冷藏時間的延長而逐漸增大。分析原因可能是在冷藏過程中，保加利亞乳桿菌LB6繼續生長繁殖，菌體的生長消耗殘存的乳糖產生乳酸，導致酸度進一步升高。因菌株LB6與ST的產酸能力較強[23]，故冷藏0～14 d，酸度一直迅速增長，冷藏14～28 d，酸度趨于穩定，酸度達到180°T。而國標GB.19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》中規定酸牛奶的酸度≥70.0°T時終止發酵，酸乳制品的酸度應該在70.0～110.0°T。而本研究發現，酸牛奶的國標可以作為參考，但并不能完全適用于發酵羊乳。因為酸度在70.0～80.0°T時，不能使羊奶中的蛋白形成固體狀酸凝乳。通過試驗驗證，酸羊乳發酵終止酸度應在90.0°T左右較合適，即使發酵羊乳冷藏后酸度達到150.0°T，在感官評價時依然可以接受。

在冷藏過程中，發酵羊乳的總活菌數隨著冷藏時間的延長呈先增大后減小趨勢。總活菌數在冷藏7d時達到最大值（OD600nm值=0.32）。雖然低溫低酸的環境已經不再適合菌體的生長，但由于生長慣性，菌體數量在冷藏1～7 d內仍呈上升趨勢。而隨著冷藏過程中酸羊乳pH的下降和酸度的升高，菌體生長受到其代謝產物的抑制，則加劇了菌體的死亡，從而導致7～28 d內總活菌數逐漸下降。

2.2.2 冷藏過程中發酵羊乳ACE抑制率和感官評價的變化

ACE抑制率的大小直接關乎發酵養乳中ACE抑制肽活性的大小，ACE抑制率越大說明抑制肽活性越高，那么降血壓的效果也就越好。綜合色澤、氣味、滋味、組織結構四項對發酵羊乳進行感官評價，發酵羊乳的ACE抑制率和感官評價見圖3。

圖3 冷藏過程中混菌發酵羊乳ACE抑制率與感官評價的變化Fig.3 Changes of ACE inhibition rate and sensory evaluation of fermented goat milk by mixed fermentation during refrigeration

由圖3可知，在發酵3 d內，發酵羊乳的ACE抑制率有所增加，發酵3d時ACE抑制率達到76.16%，低于SHUGW等[24]以L.plantarumLP69單菌株發酵羊乳的ACE抑制率（84.27%），高于以L.bulgaricusLB6單菌株發酵的酸羊乳ACE抑制率（74.70%）；發酵3d以后，ACE抑制率逐漸減小；發酵28 d時，ACE抑制率下降至20.19%，說明在發酵過程中ACE抑制肽的損失相當嚴重，分析原因可能是冷藏過程中菌體破壞了抑制肽的生物結構。

發酵羊乳在冷藏3 d時，感官評分最高為8.24分，此時口感最佳，酸甜適中，膻味較輕；隨著發酵的進行，酸化越來越嚴重，致使發酵羊乳過酸，使人無法接受，因此感官評價分數逐漸降低（7.83～7.23分）。

2.2.3 冷藏過程中發酵羊乳質構的變化

冷藏過程中發酵羊乳的質構特性變化結果見圖4。

圖4 冷藏過程中發酵羊乳質構特性的變化Fig.4 Changes of texture properties of fermented goat milk during refrigeration process

由圖4可知，隨著冷藏時間的延長，發酵羊乳的硬度、稠度、凝聚性和黏度均呈先增大后減小的趨勢。其中，發酵羊乳的硬度在冷藏14 d時達到最大值（0.078 g），冷藏14～21 d內隨著冷藏時間的延長硬度逐漸減小，21～28 d時硬度變化趨于平緩；發酵羊乳的稠度在冷藏7 d時，稠度達到最大，為1.43 g；而凝聚性與黏度分別在冷藏3 d（0.078 g）和7d（0.179g·s）時達到最大。本研究得到的發酵羊乳在4℃條件下冷藏期達到14 d時，發酵羊乳的質構特性最佳：硬度為0.078g、稠度為1.92g·s、凝聚性為0.078g、黏度為0.179g·s。3結論

全因子試驗設計得到混菌發酵羊乳的最佳發酵條件為菌株比例LB6∶ST=1∶1，發酵溫度42 ℃，發酵時間3.5 h。在此最優發酵條件下，發酵羊乳的ACE抑制率、活菌數OD600nm值和感官評分分別為78.37%、0.22、7.35分。在冷藏過程中，隨著冷藏時間的延長，發酵羊乳的pH值逐漸減小，酸度逐漸增大，感官評分、ACE抑制率、活菌數、硬度、稠度、凝聚性與黏度均呈先增大后減小的趨勢。