紫色紅曲霉中新型酯酶ESM1的純化及其酶學特性研究

張 玉，周冉冉，李可心，黃 宇，陳茂彬*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068；3.工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068）

酯酶（EC 3.1.1.1）是能催化芳香酯、脂肪酸酯等水解的酶的統稱[1]，在化學合成、食品調味品和醫藥工業領域應用廣泛[2-4]。源于真菌的酯酶可以催化水解作用的逆反應，即合成反應，如在非水性環境中的酯化作用和酯交換等反應[5]。酯酶在有機溶液中的催化合成反應具有增加疏水性底物的溶解度[6]、朝向合成的熱力學平衡轉移[7]和底物特異性改進[8]等優點。

酯酶可以從微生物，特別是細菌和真菌中高量生產[9]。根據生物學特性和保守區序列，細菌中的酯酶被劃分為8個家族[10]，且近些年來不斷報道出新的家族成員[11-14]。然而，只有一部分酯酶進行了結構和功能的鑒定[15-17]。從真菌中也分離和純化出一些酯酶，前期報道，在中國傳統發酵紅米中發現了116個紫色紅曲霉（M.purpureus）M7的候選酯酶基因，在這些酯酶基因中，只有酯酶Lip10和Lip2屬于新的酯酶家族成員[14，18]。

雖然一些酯酶已經被分離、鑒定，但是尋找具有更高的熱穩定性和更寬的底物選擇性的新型酯酶仍迫在眉睫[19]。酯酶在工業生產過程中需要反復使用，因此，需要相當好的穩定性，且真菌產生的酯酶通常是胞外酶，很容易通過純化獲得[20]。因此，本研究以白酒高溫大曲中篩選出的一株耐高溫酯酶產生菌株HQ為研究對象，對其進行了分子生物學鑒定，并對其所產的酯酶進行分離純化、分子特性分析和酶學特征研究，為現代工業生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株HQ：分離自白酒高溫大曲，-4℃保存備用。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶（250 U/mg）：北京華邁科生物技術有限責任公司；PTH-氨基酸標品（純度＞98.0%）：日本Shimadzu Corporation公司；其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.1.3 培養基

種子培養基：葡萄糖1%，酵母膏0.5%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO40.2%。115℃滅菌30 min。

液體發酵培養基：蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MnSO40.03%。用乳酸調pH值為6.0，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2112B恒溫培養振蕩器、ZHJH-1214B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造公司；Tanon-1600凝膠成像系統：上海天能公司；ultrafleXtreme基質輔助激光解吸電離-飛行時間-質譜（matrix-assisted laser desorption ionizationtimeofflight-massspectroscopy，MALDI-TOF-MS）、ultimate 3000色譜儀：美國布魯克·道爾頓公司；PPSQ-31A蛋白測序儀：日本島津公司；AKTA prime plus柱層析系統：美國GE Healthcare公司；丁基瓊脂糖柱26/60 Superdex G-200柱：美國Amersham公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分子生物學鑒定

按照SAMBROOK J等[21]的方法提取菌株HQ的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），根據18S rDNA的D2序列設計一對通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。采用引物對ITS1/ITS4進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR擴增體系：無菌水 17.8 μL，Buffer：3 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphated，NTP）2 μL，ITS1 3 μL，ITS4 3 μL，DNA模板1 μL，Taq酶 0.2 μL；PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10min。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠進行驗證，PCR擴增產物送至華大基因公司測序，測序結果在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上進行Blast比對搜索，獲得同源性較高菌株序列，采用MEGA軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，確定菌株的親緣關系。

1.3.2 粗酶液的制備

種子液的制備：挑取斜面上的紫色紅曲霉HQ接種于種子培養基，于30℃、180 r/min條件下培養4 d后過濾，制成種子液備用。

液體發酵：按10%（V/V）的接種量將種子液接種于含50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中。先靜置12 h，然后在30℃、180 r/min的條件下培養。接種后每隔12 h取一批樣，每批取3次，用4層紗布過濾，菌絲用無菌水沖洗幾次，直至表面色素清洗干凈，烘干稱質量。同時測定發酵液中酯酶的酶活性。

1.3.3 胞外酯酶的分離純化

液體發酵5 d后，將培養液在濾紙上過濾，去除菌絲體。添加終濃度為2 mmol/L的芐脒（絲氨酸蛋白酶抑制劑）到液體發酵液中，以防止整個純化過程中蛋白質發生水解。

利用硫酸銨分級沉淀純化發酵液中的酯酶[22]。取6份50 mL粗酶液，分別向每份粗酶液中緩慢加入碾細的（NH4）2SO4粉末，使其飽和度分別為0、20%、30%、40%、50%、60%，（NH4）2SO4溶解后靜置30 min，10 000×g、4 ℃條件下離心15 min，測定上清液酯酶活力。選取酯酶活力最高的上清液按體積均分為6份，分別加入（NH4）2SO4粉末，使其飽和度分別為70%、75%、80%、85%、90%，待（NH4）2SO4充分溶解后，靜置30 min，10 000×g、4℃條件下離心15 min，棄上清，收集沉淀。將上述沉淀用20mmol/LTris-HCl（pH 8.0）緩沖液充分溶解，定容至25 mL，檢測剩余酯酶活力。

在上述酶活力最高的基礎上，10 000×g、4℃條件下離心15 min，將上清液加入到丁基瓊脂糖柱（2.5 cm×30 cm），利用10倍柱體積的含有1 mol/L（NH4）2SO4的20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液沖洗，以除去未結合的蛋白質。然后以2mL/min的流速將酯酶梯度洗脫至含（NH4）2SO4（0～1mol/L）的20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中，總體積超過4個柱體積，收集10mL的餾分。將含有酯酶活性的組分匯集[23]。

采用Superdex G-200柱進行進一步分離。利用含有150 mmol/L NaCl的10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液洗脫柱子，流速為1 mL/min。收集組分，檢測酯酶活力。所有純化步驟在4℃進行。

1.3.4 分析檢測方法

酯酶活力的測定：參照KORDEL M等[26]的方法測定酯酶活力。取10 mL環己烷、3.55 mL乙醇、6.25 mL己酸（所有試劑每500 mL中加入30 g無水硫酸鈉）以及0.2 mL酶液，在100mL的密閉錐形瓶中進行酯化反應，反應溫度為35℃。反應24h后取上清液0.5mL于50mL錐形瓶中，加入5mL水，2滴酚酞，用0.1 mol/L NaOH滴定至終點，測定己酸的消耗量。酯酶活力單位定義：在測定條件下每分鐘消耗1 μmol己酸所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。

蛋白質含量的測定：采用Bradford法[27]。

蛋白質分子質量的測定：采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（12%丙烯酰胺）進行測定[28]。

1.3.5 蛋白質質譜分析

采用SDS-PAGE（12%丙烯酰胺）分離純化酯酶后，回收蛋白條帶，用胰蛋白酶裂解得到肽混合物。采用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）檢測蛋白質結構。通過檢測器收集分離的離子，并測定每個離子的質子數與電荷數的比值（m/z值），從而獲得蛋白質的質譜分析結果。

1.3.6 蛋白質N端測序

采用SDS-PAGE（12%丙烯酰胺）分離0.5nmol的純化酯酶，并用電印跡法將其轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidencefluoride，PVDF）上。從CBB-R250染色的PVDF印跡中切下酯酶條帶，利用蛋白測序儀建立標準氨基酸圖譜，確定純化的非變性酯酶的N-末端序列。

1.3.7 酯酶酶學性質研究

（1）溫度對酯酶活性和穩定性的影響

將純化得到的酯酶加入到酯化反應體系中，分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃條件下進行酯化反應，測定酯酶活力。以酶活力最大值為100%，計算相對酶活。

將酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下水浴60 min，每隔10 min取樣在37℃條件下進行酯化反應，測定剩余酯酶活力，并以未保溫時的酶活力為100%，計算相對酶活。

（2）pH值對酯酶活性和穩定性的影響

分別用pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.25 mol/L）、pH 5.0、6.0、7.0的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液（0.25 mol/L）及pH 7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl緩沖液（0.25 mol/L）配制底物反應液，測定其酯酶活力，并以酶活力最大值設定為100%，計算相對酶活。

將酶液分別置于上述對應的pH緩沖液中于4℃放置過夜，測定剩余酶活力，以pH7.2處理下的酯酶酶活力（100%）作為對照，計算相對酶活。

（3）金屬離子對酯酶活性的影響

在溶解酯酶的10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖溶液中分別添加Ca2+（CaCl2）、Mg2+（MgSO4·7H2O）、Mn2+（MnCl2）、Zn2+（ZnSO4·7H2O）、Cu2+（CuSO4·7H2O）、Fe2+（FeSO4·7H2O）等二價金屬離子至終濃度為5mmol/L，測定酯酶活力，以不加金屬離子的酯酶酶活為100%，并計算相對酶活。

2 結果與分析

2.1 菌株的分子生物學鑒定

在黃山頭酒廠的紅心大曲中分離出一株產酯酶的紅曲霉菌株，編號為HQ-1，采用分子生物學對其進行菌種鑒定，其系統發育樹如圖1所示。

由圖1可知，菌株HQ與Monascus purpureusMp-41聚于一支，親緣關系最近，因此，確定該菌株HQ為一株紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。

圖1 菌株HQ的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain HQ

2.2 發酵時間對酯酶活性的影響

紫色紅曲霉HQ發酵過程中酯酶活性和菌體干質量的變化如圖2所示。

圖2 紫色紅曲霉HQ發酵過程中酯酶活力和菌體干質量隨培養時間的變化規律Fig.2 Changes of esterase activity and dry weight of mycelia of Monascus purpureusHQ with culture time during fermentation process

由圖2可知，菌株HQ在發酵過程中，培養46 h后，菌株HQ進入快速生長期，細胞生長量快速增加，96 h達到穩定期，生長110 h后，細胞生長量開始減少，進入衰亡期。發酵液中的酯酶活力隨培養時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，72 h時達到最大值（5.8 U/mL），繼續培養酯酶活力開始下降，96 h時達到4.8 U/mL。

2.3 胞外酯酶的分離純化

兩步硫酸銨沉淀法中硫酸銨濃度與酯酶活性的對應關系見圖3。

由圖3A可知，當硫酸銨飽和濃度為50%時，殘留酯酶活性最高，為7.82 U/mL。因此，在第一沉淀步驟中選擇50%硫酸銨飽和濃度。由圖3B可知，經50%飽和硫酸銨處理后的粗酶液，再次添加硫酸銨，硫酸銨飽和濃度達到80%時，酯酶活力最大，為10.53 U/mL，飽和度＞80%之后，酯酶活力急劇減小。因此在第二次沉淀步驟中選擇硫酸銨飽和度為80%。

圖3 兩次硫酸銨鹽析沉淀的硫酸銨飽和濃度與酯酶活力的對應關系Fig.3 Correspondence relationship between ammonium sulfate saturation of ammonium sulfate two-stage precipitation and esterase enzyme activity

二步飽和硫酸銨鹽析處理得到的沉淀用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶解，加入到丁基瓊脂糖柱中，以含不同濃度硫酸銨的20mmol/LTris-HCl（pH8.0）緩沖液梯度洗脫，將具有最大酯酶活力的組分收集合并，然后利用Superdex G-200柱純化，純化后進行SDS-PAGE（12%丙烯酰胺），結果如圖4所示。

圖4 SDS-PAGE圖Fig.4 Electrophoretogram of SDS-PAGE

由圖4可知，經二步飽和硫酸銨鹽析、丁基瓊脂糖凝膠柱和Superdex G-200柱純化，酯酶經SDS-PAGE（12%丙烯酰胺）分離后顯示出單一的蛋白條帶，表明該蛋白具有高純度，且其分子質量為60 kDa，命名該蛋白質為ESM1。酯酶ESM1的純化結果見表1。

表1 肽段序列比對結果Table 1 Comparison results of peptide sequence

由表1可知，經二步硫酸銨沉淀和丁基瓊脂糖凝膠柱純化后，檢測到的總蛋白含量為0.59 mg，經過Superdex G-200柱純化后，最終獲得的酶蛋白含量為0.06mg。200mL粗酶液經純化后大約能獲得0.06 mg的純酯酶蛋白。

2.4 蛋白質質譜分析

通過MALDI-TOF-MS分析，獲得酯酶ESM1的肽質量指紋圖譜，結果如圖5所示。酯酶ESM1的肽段序列比對結果見表2。

圖5 酯酶ESM1的質譜圖Fig.5 Mass spectrogram of esterase ESM1

表2 肽段序列比對結果Table 2 Comparison results of peptide sequence

注：OS代表物種名；GN代表在Genbank中名字；PE代表蛋白質存在（后面數字代表蛋白質存在的個數）；SV代表序列版本。

由表2可知，在NCBI中經比對發現，在紅曲中有一種酸性蛋白質與篩選得到的蛋白質匹配得分最高為199分。純化得到的酯化酶分子質量在60 kDa，而最高得分的酸性蛋白質只有41 kDa，可以說明純化得到的蛋白質包含有一部分酸性蛋白質的肽段序列。

2.5 酯酶N-末端氨基酸序列分析

使用蛋白質測序儀檢測純酯酶ESM1的前10個N-末端氨基酸殘基序列，N-末端氨基酸殘基序列為AOPEEDAAND。通過氨基酸殘基比對發現，該酯酶與其他真菌菌株的酯酶無同源性。

2.6 酯酶ESM1酶學性質的研究

2.6.1 酯化溫度對酯酶活性及穩定性的影響

酯化溫度對酯酶ESM1活性及穩定性的影響如圖6所示。

圖6 溫度對酯酶ESM1活性（a）及穩定性（b）的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity(a)and stability(b)of esterase ESM1

由圖6a可知，酯酶ESM1的最適溫度為60℃。當溫度＜60℃時，酶活性隨溫度的升高而增加；溫度＞65℃之后，酶活性急劇下降。由圖6b可知，在30℃條件下水浴60min內，酯酶活性變化不顯著（P＞0.05），因此酯酶ESM1在30℃時具有較好的穩定性；當溫度升高至50℃時，酯酶ESM1活性隨水浴時間的延長而降低，40min后趨于穩定，相對酶活為60%；溫度達到60℃時，酯酶ESM1的半衰期為15 min；水浴溫度達到70℃時，水浴8min后相對酶活＜50%，隨后，隨著水浴時間的延長，酯酶活性迅速下降，70℃時酯酶半衰期為8min。

2.6.2 pH值對酯酶活性和穩定性的影響

pH對酯酶ESM1活性及穩定性的影響結果如圖7所示。

圖7 pH對酯酶ESM1活性（a）及穩定性（b）的影響Fig.7 Effect of pH on the activity(a)and stability(b)of esterase ESM1

由圖7a可知，當反應體系的pH值為4.0時，相對酶活僅為10%，說明在該pH條件下酯酶ESM1活性受到抑制；隨著pH的升高，酯酶ESM1活性在pH值為7.0時達到最大值；在pH值為7.5時，酯酶活性略有下降；當pH＞7.5之后，酯酶ESM1活性急劇下降，表明ESM1在中性條件下具有較高的活性。由圖7b可知，當pH值為4.0時，酯酶ESM1相對酶活最低，為8%，表現出對強酸的不耐受性；隨著pH值的增加，酯酶活性逐步升高，pH值為7.0時酯酶ESM1相對酶活達到最大，且表現出較好的穩定性。隨著pH的進一步升高，酯酶活性下降，在pH為9.0時，酯酶ESM1活性最低。

2.6.3 金屬離子對酯酶ESM1活性的影響

不同金屬離子對酯酶ESM1活性的影響結果見圖8。

圖8 金屬離子對酯酶ESM1活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of esterase ESM1

由圖8可知，Zn2+、Ca2+和Na+對酯酶ESM1活力有促進作用，其中Zn2+促進作用最高，而Cu2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+對酯酶ESM1活力有抑制作用，其中Cu2+表現出較強的抑制作用，抑制60%的酯酶活力，分析原因可能是由于Cu2+影響底物與酯酶的催化活性中心結合，使酯酶利用底物效率降低。Mg2+、Fe2+、Mn2+分別表現出97%、86%、70%、98%的抑制。

3 結論

本研究從白酒高溫大曲中篩選出一株產酯酶的菌株HQ，經分子生物學鑒定為紫紅曲霉（Monascus purpureus）。從M.purpureus的液體發酵液中分離純化得到高活性酯酶，命名為ESM1。經質譜分析和N端測序發現，純化后的酯酶分子量為60 kDa，具有酸性蛋白酶序列，是一種尚未報道的新型酯酶。ESM1酶學性質研究表明，ESM1在60℃、pH 7.0條件下具有良好的酯化能力，在溫度為50℃的環境和中性環境中表現出良好的穩定性，Zn2+有助于提高酯酶ESM1的活性，而Cu2+抑制ESM1的活性。紫色紅曲霉為傳統發酵白酒生產中的菌種選擇、優化或酶的直接添加提供了基礎，同時也為生產更優質的白酒提供了可能。