利用猴頭菌發酵大果山楂汁的條件優化研究

張 巧，陳春喜，吳天保

（1.賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899；2.賀州學院食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899；3.廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西 賀州 542899）

大果山楂（Crataegus pinnatifidaBge.var.major N.）又名烏蟬子（廣西苗語）、麻缺頓、墨雞屯（廣西壯語），是由小果南山楂經選育嫁接而成的藥果兼用樹種，是廣西的特色農產品之一[1]。與普通山楂相比，大果山楂果粒大，易加工與儲藏，鮮食味道可口且營養豐富[2]。大果山楂醫用價值較高，具有開胃健胃、增強心肌收縮力、防止心率紊亂、降壓利尿和鎮靜等作用，在降血脂、降血糖、抑菌、抗腫瘤等方面均有一定的功效[3-5]。

猴頭菇（Hericium erinaceus）是一種珍貴的藥食兼用的大型真菌，具有抗衰老、降血脂、抗腸胃潰瘍、提高免疫力和抗腫瘤等作用，在治療胃潰瘍、慢性胃炎等胃部疾病方面效果明顯，其活性成分主要是猴頭菇多糖[6-8]。目前市面上的猴頭菇產品主要是以猴頭菇子實體為原料，制成猴頭菇餅干、猴頭菇飲料以及一些猴頭菇營養湯料等[9]。這些產品雖然具有猴頭菇豐富的營養價值，但野生猴頭菇資源有限，人工栽培周期長、產量低。而猴頭菌的液體發酵可以在短時間內獲得大量的菌絲體和發酵產物，且成本低，工藝簡單，是一種獲取猴頭菇營養價值的重要手段[10]。

本研究結合大果山楂和猴頭菇豐富的營養及保健價值，以大果山楂汁為主要培養基原料，對猴頭菌的發酵條件進行優化，為大果山楂猴頭菇飲料的開發和生產提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菌：廣東省微生物菌種保藏中心；大果山楂：賀州市水果建材批發市場；果膠酶（酶活力3萬U/g）、酸性纖維素酶（酶活力1萬U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；硫胺素：上海源葉生物科技有限公司；濃硫酸：西隴化工股份有限公司；苯酚：成都市科龍化工試劑廠。所有實驗試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potatodextroseagar，PDA）：20%馬鈴薯汁1 L，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，瓊脂20g，pH自然，115℃高壓滅菌20min。

1.2 儀器與設備

JYZ-D526九陽榨汁機：九陽股份有限公司；KDC-40低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；ZWYR-2012C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；KRQ-250A人工氣候箱：上海齊欣科學儀器有限公司；722N可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；FJ200高速分散均質機：上海標本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

（1）菌種的活化

用接種鏟從猴頭菌斜面上切出1～2塊1 cm2的菌絲塊轉接到PDA斜面培養基的中間，菌絲朝上，于26℃的培養箱里培養10～25 d，直至菌絲滿管。活化2～3代，使菌株活力達到最強。

（2）種子液的制備

將活化后的猴頭菌接種至PDA液體培養基中，培養溫度26℃，培養時間為7～10 d，待用。

1.3.2 大果山楂汁的制備

挑選新鮮、無損傷的完整大果山楂，經清洗瀝干后切塊去核，加入到0.3%的抗壞血酸溶液中進行護色，其中山楂果肉∶護色液=1∶1.5（g∶mL），打成勻漿，分別加入勻漿質量0.3%的果膠酶和纖維素酶，混勻后放入45℃的恒溫水浴鍋中攪拌酶解2.5 h，然后在沸水中加熱滅酶5 min，立即用冷水冷卻至室溫，過濾。在濾液中加入5 g/L的白砂糖，分裝，裝液量60 mL/250 mL，密封，于80℃的恒溫水浴鍋中保溫15 min進行滅菌。

1.3.3 發酵液中多糖的提取及測定

第三，通過完善“互聯網+”的建設，使基礎信息數據具有整合性的特質，從而保證數據的方向型傳輸。進而使數據的收集、數據的運用、數據的儲存能在校園數據庫中進行整合、分析和處理。特別是需要根據“互聯網+”的功能分層做出相應調研，使教學、管理和信息的傳遞功能不會因數據的混亂而造成整合發生偏差。

多糖的提取[11]：取一定量的發酵液，使用高速分散均質機（直徑12 cm，10 000 r/min）均質5 min，使猴頭菌菌絲斷裂，在冰浴條件下進行超聲波破碎菌絲（200 W，超聲1 s，停2 s，總時間30 min），離心（10 000 r/min，10 min），取10mL上清液，加入30mL的預冷體積分數為95%的乙醇，4℃條件下放置過夜。離心（8000r/min，20min），沉淀用體積分數為75%的預冷乙醇清洗表面，室溫放置1 h，待表面乙醇完全揮發，用2mL蒸餾水溶解均勻，離心（10 000 r/min，10 min），測定上清的多糖含量。

多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[12]進行測定。取稀釋樣液1 mL，加入0.5 mL的5%苯酚，搖勻后加入2.5 mL的濃硫酸，混合均勻，沸水中加熱20 min，立刻取出置于冷水中冷卻至室溫，測定其在波長490 nm處的吸光度值。采用0～1.0 mg/mL的葡萄糖溶液制備標準曲線，得線性回歸方程：y=1.432x-0.005，R2=0.999，根據葡萄糖標準曲線回歸方程計算發酵液中形成的多糖，其含量計算公式如下：

C=C1-C0

式中：C為發酵液中形成的多糖含量，mg/mL；C1為發酵液中的多糖含量，mg/mL；C0為初始大果山楂汁的多糖含量，mg/mL。

1.3.4 菌絲濕質量的測定

將猴頭菌發酵液離心（8 000 r/min，20 min），去掉上清，將離心管室溫下倒置2h，待管壁周圍水分蒸發完全，稱質量。

1.3.5 單因素優化試驗

在酶解后的大果山楂汁中分別添加0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L的白砂糖，混勻后進行分裝滅菌，分別接種2%、4%、6%、8%、10%的猴頭菌種子液，分別在22℃、24℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，轉速120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min的條件下發酵10 d，測定發酵液中形成的多糖含量和菌絲濕質量。

1.3.6 發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，設計4因素3水平正交試驗進行優化，從而確定猴頭菌發酵大果山楂汁的最優條件。

表1 猴頭菌發酵條件正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization byHericium erinaceus

2 結果與分析

2.1 白砂糖添加量對多糖含量及菌絲濕質量的影響

山楂的營養組成特點是酸高，而糖含量相對較低[13]。李宇偉等[14]研究果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖等碳源對猴頭菌液體培養產多糖的影響發現，蔗糖是最合適碳源。因白砂糖的主要成分是蔗糖，且經濟易得，因此本研究選定白砂糖作為大果山楂汁中添加的碳源，以促進猴頭菌的生長。大果山楂汁中白砂糖的添加量對多糖含量及菌絲濕質量的影響見圖1所示。

圖1 白砂糖添加量對多糖含量及菌絲濕質量的影響Fig.1 Effect of sugar addition on polysaccharide content and mycelium wet weight

由圖1可知，在一定范圍內，隨著白砂糖添加量的增加，發酵液中形成的多糖及菌絲不斷增加，當白砂糖添加量達到10 g/L時，多糖含量與菌絲濕質量最高，說明大果山楂汁中的白砂糖得到了很好的利用，促進了猴頭菌的生長及多糖的形成。當白砂糖添加量＞10 g/L之后，多糖含量及菌絲濕質量均開始下降，可能原因在于較高濃度的糖溶液，發酵液的滲透壓較大，對猴頭菌的生長產生了一定的抑制作用。因此，大果山楂汁中白砂糖的最適添加量為10 g/L。

2.2 發酵溫度對多糖含量及菌絲濕質量的影響

菌體的生長發育是一系列酶促反應的結果，溫度能通過酶的活性調節、氧的溶解等因素影響發酵，因此溫度是影響猴頭菌發酵產多糖及形成菌絲的重要因素[15]。發酵溫度對多糖含量及菌絲濕質量的影響見圖2所示。

圖2 發酵溫度對多糖含量及菌絲濕質量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由圖2可知，在22～26℃時，隨著發酵溫度的升高，發酵液中的多糖含量及菌絲濕質量也不斷增加，提高溫度有利于促進猴頭菌的生長及多糖的形成。當發酵溫度＞26℃之后，多糖含量和菌絲濕質量均開始下降，因此，確定猴頭菌在大果山楂汁中進行發酵的最適溫度為26℃。

2.3 轉速對多糖含量及菌絲濕質量的影響

轉速大小與溶氧有一定的關系，在一定范圍內，轉速越高越利于改變溶氧效果，從而影響發酵液中猴頭菌的生長發育。轉速對多糖含量及菌絲濕質量的影響見圖3所示。

圖3 轉速對多糖含量及菌絲濕質量的影響Fig.3 Effect of rotation speed on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由圖3可知，當搖床轉速為160 r/min時，發酵液中的菌絲濕質量及多糖含量較高。當轉速＜160r/min之前，溶氧過少不利于猴頭菌的生長；當轉速＞160 r/min之后，子實體與菌絲容易結團，抑制菌絲生長[16]。因此，確定猴頭菌在大果山楂汁中進行發酵的最適轉速為160 r/min。

2.4 接種量對多糖含量及菌絲濕質量的影響

種子液接種量也是影響猴頭菌發酵的重要因素，適量的接種量有利于促進菌絲的生長及猴頭菇多糖的形成。接種量對多糖含量及菌絲濕質量的影響見圖4所示。

圖4 接種量對多糖含量及菌絲濕質量的影響Fig.4 Effect of inoculum on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由圖4可知，接種量在0～6%范圍內，隨著接種量的增加，大果山楂汁發酵液中的多糖含量也隨之增加，當接種量＞6%之后，多糖含量隨接種量增加反而下降，原因可能在于，接種量過高，猴頭菌對發酵液中多糖的消耗大于多糖的形成；此外，在0～10%范圍內，接種量增加，猴頭菌菌絲濕質量也隨之提高，當接種量＜6%之前，增長速率較快，當接種量＞6%之后，增長速率趨于平緩。因此，確定猴頭菌在大果山楂汁中進行發酵的最適接種量為6%。

2.5 發酵條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，以白砂糖添加量、發酵溫度、轉速、接種量設計4因素3水平正交試驗L9（43），以發酵10 d后的多糖含量及菌絲濕質量為考察指標，確定猴頭菌在大果山楂汁中的最佳發酵工藝，正交試驗結果見表2。

由表2的極差分析可知，以多糖含量為評價指標時，各因素對多糖含量的影響大小是A＞D＞B＞C，即白砂糖添加量影響最大，接種量次之，然后是發酵溫度，最后是轉速，最優組合是A2B2C2D3；以菌絲濕質量為評價指標時，各因素對猴頭菌絲濕質量的影響大小是A＞D＞B＞C，即白砂糖添加量影響最大，接種量次之，然后是發酵溫度，最后是轉速，最優組合是A2B2C1D3。由直觀分析可知，多糖含量及菌絲濕質量最高的條件是A3B2C1D3，對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表3的方差分析結果表明，白砂糖添加量對多糖含量影響極顯著（P＜0.01），對菌絲濕質量影響顯著（P＜0.05），而接種量對多糖含量及菌絲濕質量均有顯著的影響（P＜0.05）。此外，發酵溫度和轉速對多糖含量及菌絲濕質量則無顯著影響（P＞0.05）。

表2 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

根據各因素的最優水平，產多糖的最優組合為A2B2C2D3，產猴頭菌菌絲的最優組合為A2B2C1D3，直觀分析結果為A3B2C1D3，在這三個條件下進行發酵組合驗證試驗，每組三個平行并計算平均值，驗證結果確定猴頭菌在大果山楂汁中的發酵條件最優組合是A2B2C2D3，即白砂糖添加量為10 g/L，發酵溫度為26℃，轉速為160 r/min，接種量為8%，此條件下，多糖含量達到5.91 mg/mL，菌絲濕質量達到255.86 mg/mL。

3 結論

通過多個單因素和正交優化試驗對猴頭菌在大果山楂汁中的發酵條件進行優化，確定最佳的發酵條件：大果山楂汁中白砂糖的添加量10 g/L，發酵溫度26℃，搖床轉速160r/min，接種量8%。在此優化條件下，猴頭菌發酵10d，發酵液中的多糖含量達到5.91 mg/mL，菌絲濕質量達到255.86 g/mL。此研究確定了猴頭菌在以大果山楂汁為主要原料進行發酵的工藝條件參數，為大果山楂猴頭菇發酵飲料的開發和生產提供重要的研究基礎。