凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁的工藝優化及主要成分變化

馬若霜，方海田*，劉慧燕，王 茹，劉予煊，李金娜，趙貝貝，周 婷，胡曉磊

（1.寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium barbarumL.）為茄科多年生落葉灌木，又名貢果、血杞子、枸杞豆，其不含任何毒素，可以長期食用，是衛生部公布的可以藥食同源的中藥之一[1]。枸杞的營養成分豐富，富含蛋白質、脂肪、多糖、胡蘿卜素，維生素B1、維生素B2、多種氨基酸，具有補腎益精、養肝明目、潤肺止咳等功效，有降低膽固醇、減輕動脈硬化、降低血糖等作用[2-4]。對枸杞的應用也有諸多報道，如成堃等[5]以藍莓、枸杞、全脂奶粉為原料，研究了藍莓枸杞風味酸奶的發酵工藝；郭紅蓮等[6]通過對天然枸杞酵素發酵的代謝產物進行分析，鑒定出64種風味物質，并具有較強的自由基清除能力、還原力，總酚含量達到1.926 mg/mL；劉喜林等[7]利用植物乳桿菌對百合枸杞發酵液進行了研究；劉亞等[8]以枸杞鮮果為原料接種酵母菌發酵枸杞酒，測定分析了代謝產物中含量較多的醇類、酯類、羧酸類、醛酮類物質以及枸杞酒發酵前后類胡蘿卜素的含量變化。

但是，利用凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）對枸杞汁發酵的研究還未見報道。凝結芽孢桿菌是兼性厭氧菌，在有氧及無氧的環境下都可生長，能適應低氧的腸道環境，對酸和膽汁有較高的耐受性，能夠進行乳酸發酵，產生的L-乳酸能降低腸道pH值[9-11]，抑制有害菌，并能促進雙歧桿菌（Bifidobacterium）等有益菌的生長和繁殖。凝結芽孢桿菌能夠形成芽孢，與其他不產乳酸的芽孢桿菌相比有利于恢復胃腸道的微生態平衡[12-13]，菌體在通過腸前消化道時可保持較高的存活率，是一種有重要價值的益生菌，被衛計委批準列入新食品原料目錄[14]。

本試驗以寧夏枸杞干果為主要材料，進行凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁工藝條件優化并分析發酵期間枸杞汁中總糖、總黃酮、蛋白質、乳酸等主要成分的變化，旨在研制出一種能夠調節腸道功能的凝結芽孢桿菌枸杞汁，進而提高發酵枸杞汁的營養與風味，為凝結芽孢桿菌在發酵枸杞汁方面的應用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：中寧枸杞；凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）：中國工業微生物菌種保藏管理中心（chinacenterofindustrial culture collection，CICC），菌株編號CICC21735。

營養肉湯（nutrient broth，NB）、營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；白砂糖、小蘇打：市售；D-異抗壞血酸鈉（食品級）：江西省德興市百勤異VC鈉有限公司；蘆丁標準品（純度≥98%）、牛血清白蛋白（純度≥98%）、考馬斯亮藍G-250：北京索萊寶科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司；HSU-10手持糖量計：上海精密儀器儀表有限公司；V-5100紫外可見分光光度計：上海精科實業有限公司；PB-IO型精密PH計：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 枸杞汁制備及菌種活化

挑選完整無霉變的干枸杞，稱質量，清洗后瀝水，將浸泡的枸杞放入攪拌機中打漿，反復攪打3次使其細膩，加入混合液體積0.4%D-異抗壞血酸鈉護色，用小蘇打調節pH至6.5～7.0，巴氏滅菌。將凝結芽孢桿菌接種到滅菌的營養瓊脂培養基中，在恒溫箱中培養（發酵溫度30℃），連續傳代2～3次，使活力最終達到最佳，在三角瓶中進行擴大培養制備生產發酵劑。

1.3.2 發酵方式的確定

將枸杞汁加入5%的白砂糖，放入65℃的水浴鍋中殺菌30 min，按照接種量6%，發酵溫度30℃，進行發酵，考察靜置發酵（0 r/min）和微氧發酵（50 r/min）時枸杞汁的乳酸含量與感官評分。

1.3.3 單因素試驗設計

將枸杞汁加入5%的白砂糖，放入65℃的水浴鍋中殺菌30 min，按照接種量6%，轉速50 r/min，發酵溫度30℃進行發酵，每2 h測定其乳酸含量與感官評分。

固定發酵時間10 h，發酵溫度30℃，考察不同接種量（4%、6%、8%、10%、12%）時枸杞汁的乳酸含量與感官評分。

固定接種量6%，發酵時間10 h，發酵溫度30℃，考察不同白砂糖的添加量（3%、4%、5%、6%、7%）時枸杞汁的乳酸含量與感官評分。

固定接種量6%，發酵時間10 h，白砂糖添加量5%，轉速為0，考察不同發酵溫度（30℃、33℃、36℃、39℃、42℃）時枸杞汁的乳酸含量與感官評分。

固定接種量6%，發酵時間10 h，發酵發酵溫度30℃，考察不同轉速（25 r/min、50 r/min、75 r/min、100 r/min）時枸杞汁的乳酸含量與感官評分。

1.3.4 響應面法優化凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁工藝試驗

在單因素試驗的基礎上，進行響應面Box-Benhnken試驗設計，選擇接種量、白砂糖添加量、發酵溫度、轉速這4個因素，建立4因素3水平的響應面試驗，以乳酸含量與感官評分為響應值進行優化。兩個響應值所占權重各為50%，響應面試驗因素與水平如表1。

表1 枸杞汁發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for goji juice fermentation conditions optimization

1.3.5 測定方法

乳酸含量的測定：使用SBA-40E生物傳感分析儀測定。

感官評定：為評價不同發酵方式對制備的凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁感官評分的影響，由經過培訓的10人組成評分小組，從色澤、體態、香氣、口感4個方面對各枸杞汁樣品進行評分。評分細則如表2所示。

表2 發酵枸杞汁感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented goji juice

總糖的測定：采用苯酚-濃硫酸比色法[15]；總黃酮的測定：以蘆丁為標準品，采用分光光度法[16]；蛋白質的測定：采用考馬斯亮藍G-250法[17]；活菌數的測定：按照傾注平板法計數[18]；大腸菌群的測定：按照GB4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》中的方法進行檢測[19]。

2 結果與分析

2.1 枸杞汁發酵方式的確定

由圖1可知，當靜置發酵（轉速為0）時，乳酸菌生長和繁殖速度較慢；當微氧發酵（轉速為50 r/min）時，產生乳酸含量較高。而感官評分在微氧條件下明顯更高，凝結芽孢桿菌是兼性厭氧菌，在有氧及無氧的環境下都可生長，說明微氧的環境下能夠促進凝結芽孢桿菌生長繁殖，進行發酵產酸。綜合考慮選擇微氧條件進行發酵。

圖1 發酵方式對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation mode on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2 枸杞汁發酵條件的單因素試驗結果

2.2.1 枸杞汁發酵時間的確定

由圖2可知，前2 h內乳酸含量和感官評分變化比較緩慢，為凝結芽孢桿菌的繁殖和適應期，在2～8 h期間內，凝結芽孢桿菌利用發酵液中豐富的糖進行乳酸發酵，產生大量乳酸，感官評分上升。8～10 h內指標變化平緩，為發酵后期，凝結芽孢桿菌已將大部分糖轉化成乳酸。因此確定發酵結束周期為10 h。

圖2 發酵時間對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation time on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.2 接種量對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

如圖3所示，當接種量為4%～8%時，乳酸含量隨接種量的增加呈明顯上升的趨勢（P＜0.05）；當接種量＞8%之后，乳酸含量增長變小。感官評分隨著接種量的增大呈現逐漸減少的趨勢。當接種量為8%時，乳酸含量為151mg/100mL，感官評分為78分。考慮節約成本、簡便操作等因素，選擇接種量為8%為最適接種量。

圖3 接種量對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.3 白砂糖添加量對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

如圖4所示，隨著白砂糖添加量的升高，乳酸含量及感官評分均隨之升高；當白砂糖添加量≥5%之后，發酵液的乳酸含量增長變小，且感官評分開始降低。白砂糖添加量為5%時，乳酸含量為155 mg/100 mL，感官評分為91.2分。因此選取5%為最適白砂糖添加量。

圖4 白砂糖添加量對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.4 Effect of sugar addition on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.4 發酵溫度對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

如圖5所示，當發酵溫度較低時，乳酸菌生長和繁殖速度較慢，活菌數隨著溫度的升高而顯著增加（P＜0.05）；當發酵溫度高于36℃之后，乳酸含量呈逐漸下降的趨勢；發酵溫度在33～39℃時，感官評分差異不顯著（P＞0.05），而當溫度過高或過低時，枸杞發酵液的感官評分均較低。當發酵溫度為36℃時，枸杞汁乳酸含量為160 mg/100 mL，感官評分為88分。綜合考慮選擇36℃為最佳發酵溫度。

圖5 發酵溫度對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.2.5 轉速對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響

如圖6所示，當轉速為25～50r/min時，乳酸菌生長和繁殖速度較慢，乳酸含量隨著轉速的升高而增加（P＜0.05）。當轉速＞50 r/min之后，乳酸含量降低。凝結芽孢桿菌是兼性厭氧菌，在有氧及無氧的環境下都可生長，說明微氧的環境下能夠促進凝結芽孢桿菌生長繁殖，進行發酵產酸。在轉速為50～100r/min時，感官評分明顯降低（P＜0.05）。當轉速為50r/min時，枸杞發酵液的乳酸含量為158mg/100mL，感官評分為89分。綜合考慮選擇50r/min為最佳轉速。

圖6 轉速對發酵枸杞汁乳酸含量和感官評分的影響Fig.6 Effect of rotation speed on lactic acid content and sensory score of fermented goji juice

2.3 響應面法優化凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁工藝試驗結果

2.3.1 優化結果和方差分析

根據單因素試驗結果，由Design-Expert10.0.7統計分析軟件設計出的試驗方案如表3所示，兩個響應值所占權重各為50%，得到綜合評價（Y）對自變量接種量（A）、白砂糖添加量（B）、發酵溫度（C）、轉速（D）為的回歸方程分別為：

Y=125.70+1.54A-0.42B+1.04C+1.58D+3.00AB+1.38AC+1.25AD-5.50BC+1.25BD+3.75CD-5.52A2-5.16B2-10.73C2-4.41D2

表3 枸杞汁發酵條件優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface experiments for goji juice fermentation conditions optimization

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型中P值＜0.01，說明本試驗所選用的二次多項模型差異極顯著。失擬項不顯著（P＞0.05）。模型決定系數R=0.993 1，說明乳酸含量和感官評分的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，所以該模型擬合效果較好，可以用此模型分析和預測凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁的發酵工藝。模型中接種量（A）、發酵溫度（C）、轉速（D）、接種量和白砂糖添加量交互項（AB）、接種量和發酵溫度交互項（AC）、接種量和轉速交互項（AD）、白砂糖添加量和發酵溫度交互項（BC）、白砂糖和轉速交互項（BD）、發酵溫度和轉速交互項（CD）、接種量二次項（A2）、白砂糖添加量二次項（B2）、發酵溫度二次項（C2）、轉速二次項（D2）對響應值影響顯著。

2.3.2 因素間交互作用分析

響應面法是優化存在多因素影響試驗條件的尋優方法，通過固定數量的試驗次數連續的對試驗因素進行分析，并得到直觀的3D曲面圖進而評價各因素之間的交互作用。根據軟件Design-Expert10.0.7獲得響應值的3D曲面，分析各因素對乳酸含量的影響及各因素間的交互作用。根據等高線的形狀可以明顯地反映出試驗因素之間交互作用顯著性的強弱，例如接種量、白砂糖添加量、發酵時間、轉速及其交互作用對響應值的影響。當等高線的形狀為橢圓形或馬鞍形時，說明其交互作用顯著；當等高線的形狀為圓形時，說明其交互作用不顯著[20]。

由圖7可知，在交互作用對枸杞汁綜合評分影響中，接種量和白砂糖添加量、接種量和發酵溫度、接種量和轉速、白砂糖和發酵溫度、白砂糖添加量和轉速、發酵溫度和轉速交互項均產生了顯著影響。

圖7 不同因素交互作用對發酵枸杞汁綜合評分的影響Fig.7 Comprehensive score of different factors on lactic acid content of fermented goji juice

2.3.3 模型驗證試驗結果

對回歸方程求解，即乳酸含量達到最大值時的發酵條件為接種量8.34%，白砂糖添加量4.98%，發酵溫度36.32℃，轉速56.16r/min，最大乳酸含量達到161.66mg/100mL，感官評分為90.51分。為方便實際操作將試驗條件定為接種量8%，白砂糖添加量5%，發酵溫度36℃，轉速50 r/min，取三等分枸杞汁進行平行驗證試驗，驗證試驗所得平均乳酸含量為162 mg/100 mL，感官評分為91分。結果表明，經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值比較吻合，證明用響應面法可以有效的優化凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁的工藝。

2.4 最佳發酵條件下枸杞汁主要成分的變化

對上述發酵枸杞汁進行理化指標測定，結果表明，發酵10 h后的枸杞活菌數為2.1×108CFU/mL；總糖下降至95.6 μg/mL，蛋白質含量下降至0.2 μg/mL，總黃酮含量為0.309 mg/mL，未發生變化。

3 結論

采用響應面法對凝結芽孢桿菌發酵枸杞汁的條件進行優化，建立了乳酸含量和感官評分的回歸模型，由該模型優化的發酵條件為接種量8%、白砂糖添加量5%、發酵溫度36℃、轉速50 r/min、發酵10 h，在此最優條件下，可以得到顏色為鮮紅色、口感柔和、酸甜適中、并具有典型枸杞香味的枸杞發酵飲品。其pH值為4.40，可溶性固形物含量為10.2%，總糖含量為95.6μg/mL，乳酸含量為162mg/100mL，蛋白質含量為0.2 μg/mL，總黃酮含量為0.309 mg/mL，感官評分91分。