慢性胰腺炎干細胞治療研究進展

周顯祝 鄒文斌,2 王越 李兆申,2 廖專,2

1海軍軍醫大學附屬長海醫院消化內科，上海 200433；2上海市胰腺病研究所，上海 200433；3海軍軍醫大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，上海 200433

【提要】 慢性胰腺炎(CP)一種進行性慢性炎癥疾病，其病理特征為胰腺腺泡萎縮、破壞和間質纖維化，臨床上缺乏有效治療手段。干細胞治療是目前醫學研究的熱點方向之一，具有促進病變損傷組織修復和功能性再生的能力，未來可能成為CP患者治療的新方式。本文介紹了干細胞相關技術應用于CP治療的基礎研究現狀和臨床應用前景。

慢性胰腺炎(CP)是指由于各種原因引起的胰腺組織發生進行性炎癥反應，反復或持續性的損傷胰腺腺泡和小管，導致胰腺內、外分泌功能不足。CP的病因很復雜，與飲酒、吸煙、高脂血癥、胰腺分裂和遺傳因素等相關。CP治療主要是緩解癥狀，處理并發癥，以及保護并改善胰腺功能。針對CP的不同治療手段各有利弊，臨床常用的治療方式主要是藥物治療、內鏡治療以及外科手術治療。藥物治療方面缺少有效抗炎和抗纖維化的藥物。內鏡治療主要針對胰管梗阻性患者有效。外科手術治療創傷大，術后恢復慢，并發癥較多。因此采用更有效和微創的治療方式從根源上修復胰腺細胞與組織損傷是CP治療研究的發展趨勢。干細胞治療是目前醫學研究的熱點方向之一，具有促進病變損傷組織修復和功能性再生的能力，未來可能成為CP患者治療的新方式。本文介紹干細胞治療CP的基礎研究現狀和臨床應用前景。

一、干細胞的種類與特點

干細胞是一類具有自我更新和多向分化增殖能力的原始細胞，能產生表型和基因型與自己完全相同的子細胞。既具有生理性的更新能力，又對損傷與疾病導致的反應有修復功能。干細胞可分為3類，包括：(1)全能干細胞，含胚胎干細胞、胚胎生殖嵴細胞、胚胎瘤細胞；(2)多能干細胞，目前研究較多的是骨髓來源的干細胞，它可以分化成肝細胞，也可能分化成為胰腺細胞； (3)定向干細胞，胰腺的定向干細胞包括胚胎胰腺干細胞、胰腺導管細胞、胰島來源干細胞。根據干細胞的發育階段還可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞有潛力由單個受精卵發育成為具有各種組織器官的完整個體，其分化和增殖構成動物發育的基礎；成體干細胞的進一步分化則是成年動物體內組織和器官修復再生的基礎。 胰腺干細胞為成體干細胞，具有高度增殖及多向分化能力，具備分化成為胰腺內分泌細胞、腺泡細胞和導管細胞的潛能[1]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)于1976年首次從骨髓分離[2]，是一類具有多向分化潛能和高度自我更新能力的成體干細胞，可分化成多種細胞系，包括中胚層譜系，如軟骨細胞、骨細胞和脂肪細胞，以及外胚層和內胚層細胞[3]。 MSCs可以從骨髓、脂肪組織和臍帶中分離出來，且容易在體外擴增。MSCs有以下特點：(1)必須在標準培養條件下保持塑性貼壁; (2)表達CD105、CD73和CD90，但不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-DR；(3)可以體外分化成成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。2004年Le Blanc等[4]報道移植MSCs成功治療移植物抗宿主病患者，此后報道了多項MSCs臨床試驗。起初MSCs治療側重于其多向分化的能力，近期一些研究表明，大部分系統性輸注的MSCs被困在肺內作為栓子[5]。此外，在沒有分化和移植到受傷組織的疾病模型中，MSCs具有抑制炎癥、凋亡和纖維化的作用[6]。因此，目前臨床相關研究的重點方向已經轉向利用MSCs的旁分泌和調節功能(如抗炎作用)而非其直接分化替代組織細胞的能力。

二、干細胞治療胰腺炎的研究現狀

目前干細胞治療主要用于胰腺炎動物模型，其治療更常用于急性胰腺炎(AP)而非CP。研究中最常用的MSCs類型是骨髓和臍帶來源干細胞。鼠MSCs是最常用的治療胰腺炎的干細胞，其次為人類MSCs，極少數研究使用犬MSCs。

關于干細胞治療CP的研究[7-9]，目前尚沒有在人體上進行。這些研究均將不同來源的干細胞通過靜脈注射于CP模型鼠，并在一段時間后觀察鼠胰腺情況。研究的主要差異是干細胞來源和注射劑量以及檢測療效的時間等方面[7-8]。Sun等[9]對小鼠施用低劑量的脂肪來源的MSCs(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)進行治療。

三、干細胞治療CP的作用與機制

目前研究均觀察到干細胞治療對實驗動物的胰腺炎有明顯改善作用。發揮治療作用的途徑為兩種：旁分泌途徑和干細胞歸巢及定向分化后的細胞替代途徑。越來越多的研究表明旁分泌機制起主導作用，其分泌出特定細胞因子或抑制某些細胞因子的表達，從而發揮抗炎以及抗纖維化的作用[10]。有研究表明，人MSCs輸注可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，這種變化是通過增加小鼠中產生胰島素的胰島β細胞來介導的，表明高血糖的逆轉是通過誘導內源性胰島的再生而不是將注射的MSCs直接分化為產生胰島素的細胞[11]。旁分泌機制是目前更能被普遍認可的發揮治療作用的方式，提示可將干細胞的分泌因子分離后直接輸送給患者。另一種途徑是干細胞歸巢至受損胰腺后，分化為受損器官的細胞進行補充與修復。這種途徑的可能原因是胰腺的生理更新和損傷修復主要依靠胰腺干細胞和骨髓來源的干細胞。但在正常生理情況下，胰腺干細胞的數量并不能滿足胰腺損傷修復的需要，在胰腺損傷的自身修復過程中的作用相對較小。病理損傷時，自體骨髓MSCs可隨血液循環到達損傷的胰腺，轉化為胰腺干細胞，參與病理修復，從而恢復胰腺功能。從目前的結果來看，干細胞治療胰腺炎主要有以下幾方面效應。

1．抗炎作用與旁分泌效應：炎癥是CP病情進展的基礎，目前的研究證明，ACSs能抑制乙醇和蛙皮素誘導炎癥的作用。將腺泡細胞與干細胞共培養時，干細胞能顯著抑制腺泡細胞和胰腺星狀細胞TNF-α、IL-6等炎癥因子和纖連蛋白的表達。不僅如此，在ASCs條件培養基中培養腺泡細胞也能達到類似的效果。這種效應可能是通過干細胞的旁分泌效應所介導的，即干細胞分泌一些特殊遞質到培養基中，遞質作用于腺泡細胞，延緩甚至阻斷其炎癥因子的表達，從而達到抗炎的作用。

2．延緩纖維化：胰腺纖維化的核心環節是激活態的胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)分泌大量的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)。在正常胰腺中，PSCs呈圓形和靜止狀態，靜息態PSCs僅產生少量ECM。而在胰腺損傷的早期階段，靜息態PSCs在氧化應激、乙醇等刺激下被激活，轉化為肌成纖維樣細胞，并分泌大量ECM。同時炎癥細胞與血小板以及活化的PSCs自身也產生炎癥遞質，如單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、細胞間黏附分子-1、IL-8，這些炎癥因子通過自分泌(作用于PSCs自身)與旁分泌作用(作用于炎癥細胞及血小板)形成環路，引發正反饋，加速炎癥的過程[12]。

3．抑制炎癥因子的產生：MCP-1在單核細胞和淋巴細胞向炎癥部位的趨化中起著核心作用[13-14]。在多種纖維化疾病(包括特發性肺纖維化、系統性硬化癥和CP)中均觀察到MCP-1的過度表達[15-17]，因此MCP-1水平可能是胰腺纖維化和炎癥的重要治療靶點。有研究表明，干細胞條件培養基中培養的PSCs，其MCP-1和IL-8的表達水平顯著下降[7-8]。目前文獻中普遍得出的結論是腺泡細胞和星狀細胞在干細胞條件培養基中培養時，能減少乙醇及雨蛙素所誘導的炎癥因子產生，一方面能抑制激活態PSCs的自分泌效應，一方面也可以通過旁分泌抑制炎癥細胞和血小板釋放炎癥遞質，阻斷正反饋進程，進而抑制胰腺纖維化。

4．防止胰腺細胞死亡：最近Sun等[9]探討了干細胞靜脈輸注對CP模型小鼠胰腺細胞死亡的影響。通過特定的染色方法對凋亡細胞進行染色，發現在接受干細胞治療的CP模型小鼠中染色的凋亡細胞顯著減少，表明干細胞能保護胰腺細胞免受乙醇和蛙皮素所誘導的細胞死亡，即腺泡細胞受損減少，其釋放的細胞因子也相應減少，進而減弱了PSCs細胞的活化，減緩了胰腺纖維化的進程。

5．歸巢：干細胞有自主趨化至機體受損部位的特性。較新的研究結果表明，干細胞治療2周后，實驗動物的胰腺中有干細胞熒光蛋白表達，而在肝臟或肺組織中無表達，表明干細胞經過靜脈注射特異性地遷移到受損的胰腺處。Zhou等[7]的研究證實了該現象，在實驗的第14天和第28天從大鼠的胰腺組織中檢測出了干細胞。由于膽管梗阻，肝功能受到一定程度的損害，因而在肝臟中也檢測到干細胞，表明靜脈輸注的干細胞可以有效地到達受損組織的靜脈內。有研究報道，輸注干細胞的健康老鼠在第14天后于肺組織中鑒定出少量的干細胞，這是由于培養的MSCs直徑大于了微毛細血管(20 μm)的寬度，因此MSCs被阻塞在肺部毛細血管而無法通過[18]。但Eggenhofer等[19]研究發現不一樣的現象，通過尾靜脈對肝臟受損的小鼠注射綠色熒光蛋白標記的MSCs后24 h，肝臟和脾臟中均發現熒光，但未能從這些器官中分離出活體MSCs，表明活體MSCs靜脈輸注后不能通過肺的毛細血管床，因此作者認為先前在其他組織的一些研究檢測到的可能是來自MSCs碎片或被吞噬的MSCs，而不是活體MSCs標記(例如放射性、熒光素標記)。該研究表明，如果MSCs需要遞送到除肺以外的組織，則必須探討其他使用途徑，例如通過門靜脈給藥可將MSCs遞送至肝臟，而動脈給藥可將MSCs遞送至特定器官。

6．分化：當干細胞遷移到胰腺，通過干細胞綠色熒光蛋白與淀粉酶的共染色可以知道干細胞分化成了淀粉酶陽性的細胞，且表達了大量的腺泡細胞特異性產物[9]，說明體內歸巢至受損胰腺的干細胞分化成了腺泡樣細胞。同時體外細胞培養的研究提供了進一步的證據，即由腺泡細胞分泌的生長因子和信號分子可以導致干細胞向腺泡細胞方向分化。當與腺泡細胞共培養時，大鼠骨髓MSCs、人羊膜上皮細胞和人ASCs在體外已顯示出分化為唾液腺泡細胞的能力[20-21]。目前認為，細胞間接觸和微環境釋放營養因子(即旁分泌作用)似乎是驅動干細胞分化的原因。然而并非所有MSCs都具有相同的分化能力。據報道，在唾液腺模型中13%～18%的ASC分化為淀粉酶陽性細胞[22-23]。目前需要確認是否只有其中一部分亞群的MSCs具有分化為特定細胞的潛力，或者目前分離出的ASCs是各種不同干細胞的混合，每個干細胞已經有自己特定的分化方向，需要在各自特定環境中被觸發，例如這部分淀粉酶陽性分化潛能的細胞在唾液腺模型中被觸發。

總之，目前研究表明，MSCs可分化為淀粉酶陽性細胞，這種情況可以在細胞輸注體內后發生，也可以在ASCs與腺泡細胞共培養或在腺泡細胞條件培養基中培養時(即體外)發生。

四、總結與展望

目前的研究已經從治療效果角度闡明了干細胞能夠發揮抗炎，抑制纖維化進展等作用，但缺少針對這些效應的具體機制的研究。此外，缺少關于干細胞輸注后是否能緩解疼痛方面的研究。對于干細胞治療CP的另一個思路是體外誘導其分化為內分泌或外分泌細胞后再植入體內。內分泌細胞植入的主要問題是數量問題，對于糖尿病患者，基于細胞療法旨在替代胰腺產生胰島素的細胞。目前該方法已接近臨床上可行，但尚未達到取代外源胰島素注射治療糖尿病的程度。外分泌植入的問題是位置問題，必須實現移植的外分泌細胞產生的消化酶能通過導管遞送至腸腔。此外，與胰腺內分泌細胞替代療法不同，沒有證據證明外分泌細胞替代療法具有比目前的口服胰酶替代療法更安全、更有潛力。總之，對以上問題的機制研究將可能有助于該領域的進一步發展及加速臨床轉化的進程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突