半夏白術(shù)天麻湯≤1000Da小分子混合物含藥血清指紋圖譜研究

王淑玲，蔡梅超，扈金東，徐 男，門連匯，謝 恬

(1.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州310036；2.浙江省欖香烯類抗癌中藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 杭州 310036；3.浙產(chǎn)中藥材資源開發(fā)與應(yīng)用浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310036；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；5.山東中醫(yī)藥研究院 國家中醫(yī)藥管理局中藥分析重點(diǎn)學(xué)科，山東 濟(jì)南250014)

半夏白術(shù)天麻湯為治療高血壓病的常用經(jīng)典名方，對治療高血壓具有較好的臨床價值[1-2]。該方劑中包括半夏(9 g)，白術(shù)(15 g)，天麻(6 g)，橘紅(6 g)，茯苓(6 g)，甘草(4 g)六味中藥。中藥的化學(xué)成分是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，課題組前期分別采用半仿生提取法(semi-bionic extraction，SBE)、半仿生-酶法(semi-bionic-enzymatic extraction，SBEE)、水提法(water extraction，WE)、醇提法(alcohol extraction，AE)對半夏白術(shù)天麻湯進(jìn)行了提取，并對不同方法提取物的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了研究[3]。SBE法為口服給藥的中藥及其復(fù)方的一種提取技術(shù)，由張兆旺教授等首先提出[4-6]。SBEE法是基于SBE法，引入生物酶提取技術(shù)，仍然堅(jiān)持“有成分論，不惟成分論，重在機(jī)體藥效學(xué)反應(yīng)”的理論體系，更堅(jiān)持以單體、活性混合物，指紋圖譜,血清指紋圖譜及藥效學(xué)等為考察指標(biāo)。WE法即“煎煮法”，是將藥材和水熬煮取汁的方法。AE法是采用乙醇進(jìn)行提取的方法。中藥有效成分大多為小分子物質(zhì)，小分子物質(zhì)吸收入血液發(fā)揮藥物的直接或者間接作用[7-8]。本研究對4種不同提取方法的提取液中≤1000 Da小分子混合物進(jìn)行含藥血清指紋圖譜研究，比較不同提取方法的半夏白術(shù)天麻湯小分子物質(zhì)的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 選用健康SD大鼠40 只，250±20 g，雄性，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。半夏、白術(shù)、天麻、橘紅、茯苓、甘草購于陜西信瑞生物科技有限公司，色譜純乙腈購自天津賽孚瑞科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent1100高效液相色譜儀購于美國安捷倫公司，超濾(UF)/微濾(MF)設(shè)備購于杭州凱濾膜技術(shù)有限公司，MS105DU電子天平購于河北科創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器銷售有限公司。

1.3 小分子混合物樣品液制備[9]將處方中藥分別粉碎，按比例稱取10～20 目的粗粉。①SBEE液的制備：方藥粗粉用纖維素酶(以飲片質(zhì)量計(jì))預(yù)處理 24 h后提取3次，提取用水量依次為粗粉質(zhì)量的10、8、8 倍；第1煎加入0.5 %胃蛋白酶，第3煎加入1 %胰蛋白酶(以提取用水體積計(jì))；水的pH值依次為2.0、6.5、9.0；提取時間依次為90、60、60 min；提取溫度為61±1 ℃；提取液依次粗濾后3500 r/min離心25 min后取上清。②SBE液的制備：方藥粗粉提取3 次，提取用水量依次為粗粉質(zhì)量的10、8、8 倍；水的pH值依次為 2.0、6.5、8.5；提取時間依次為120、90、90 min；提取液依次粗濾后3500 r/min離心25 min后取上清。③WE 液的制備：方藥粗粉提取 3 次，提取用水量依次為粗粉質(zhì)量的10、8、8 倍；提取時間依次為120、90、90 min，提取液依次粗濾后3500 r/min離心25 min后取上清。④AE液的制備：方藥粗粉用80%乙醇提取3次，提取用醇量依次為粗粉質(zhì)量的10、8、8 倍；提取時間依次為1、0.5、0.5 h；提取液依次粗濾后3500 r/min離心25 min后取上清。4種方法的提取液再分別用超濾/微濾(UF/MF)設(shè)備選取一定規(guī)格的中空纖維膜，按照分子量的大小依次過濾，合并濃縮至2.83 g/mL，即得≤1000 Da小分子混合物SBEE樣品液(簡稱SBEE液)、≤1000 Da小分子混合物SBE樣品液(簡稱SBE液)、≤1000 Da小分子混合物WE樣品液(簡稱WE液)、≤1000 Da小分子混合物AE樣品液(簡稱AE液)。

1.4 含藥血清樣品制備 將大鼠隨機(jī)分為空白對照組和給藥組，每天灌胃2次，連續(xù)灌胃3 d，給藥組以3.0 g/kg劑量分別灌胃4種小分子混合物樣品液，空白對照組灌胃等質(zhì)量的生理鹽水。分別于灌胃后2 h采用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠，肝門靜脈取血5 mL，待血液凝固后3500 r/min離心20 min取上清液2 mL，分別加4倍體積的甲醇，渦旋混勻5 min，3500 r/min離心20 min取上清液，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈伞３恋砑?.5 mL甲醇溶解，3500 r/min離心20 min取上清液，即得4種提取方法的≤1000 Da小分子混合物含藥血清樣品，分別簡稱為SBEE液含藥血清樣品、SBE液含藥血清樣品、WE液含藥血清樣品、AE液含藥血清樣品。

1.5 含藥血清樣品指紋圖譜繪制 采用Agilent1100高效液相色譜儀，DiamonsilTMC18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，色譜條件：流動相為乙腈(A)-水(B)；線性梯度洗脫時間為0min→45 min(A%：5%→45%)，45 min→60 min(A%：45%→100%)，60min→65min(A%：100%)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；參比波長為400 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.6 含藥血清指紋圖譜檢測指標(biāo) 根據(jù)共有峰的重疊率公式(1)分別計(jì)算SBEE液、SBE液、WE液、AE液含藥血清指紋圖譜共有峰的重疊率。根據(jù)公式(2)、(3)，計(jì)算SBEE液含藥血清指紋圖譜與其他3種提取液含藥血清指紋圖譜之間的差異率和總差異率。以SBEE液含藥血清指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)圖譜，利用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦值與歐氏距離測度方法，按公式(4)、(5)、(6)，分別計(jì)算不同方法提取液含藥血清指紋圖譜的相似度。

式中：a為共有峰；x為SBEE液、SBE液、WE液、AE液峰數(shù)；c為SBEE液峰數(shù)。

式中：Aj為待測供試液中某個特征峰的面積；Ai為SBEE供試液中某個特征峰的面積；n為特征指紋峰的總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ≤1000 Da小分子混合物含藥血清指紋圖譜 SBEE、SBE、AE、WE液含藥血清指紋圖譜見圖1，選取含藥血清指紋圖譜中一個共有的、峰面積較大、分離度大于1.50的色譜峰為內(nèi)參照峰(保留時間為42.196 min)。SBEE液、SBE液、WE液、AE液含藥血清指紋圖譜中分別有19、16、16、17個特征峰，其中SBE液、WE液、AE液含藥血清指紋圖譜的特征峰均在SBEE液含藥血清指紋圖譜中出現(xiàn)。4種方法提取液≤1000 Da小分子混合物含藥血清HPLC指紋圖譜特征峰總面積大小依次為：SBEE(3995.2 mAU/min)>SBE(3589.4 mAU/min)>AE(3394.0 mAU/min)>WE(2092.0 mAU/min)。

A. SBEE液含藥血清樣品；B. SBE液含藥血清樣品；C.WE液含藥血清樣品；D. AE液含藥血清樣品。圖1 4種方法提取液≤1000 Da小分子混合物含藥血清HPLC色譜圖(2 h)

2.2 含藥血清指紋圖譜共有峰重疊率比較 選擇峰總面積最大、特征峰數(shù)最多的SBEE液含藥血清指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)圖譜，根據(jù)共有峰的重疊率公式(1)分別計(jì)算SBEE液與SBE液、WE液、AE液含藥血清指紋圖譜共有峰的重疊率，AE液與SBEE液含藥血清指紋峰重疊率(89.47%)最高，SBE液(84.21%)、WE液(84.21%)與SBEE液含藥血清指紋峰重疊率次之。

2.3 強(qiáng)峰峰面積差異率和總差異率比較 峰號為3、4、8、10、12、14、15、16、17、18、19的特征峰峰面積較大，SBEE液含藥血清指紋圖譜特征峰面積與其他3種提取液含藥血清指紋圖譜之間的總差異率大小依次為：WE(5.7198%)>AE(5.6975%)>SBE(4.9289%)，見表1。

表1 含藥血清指紋圖譜強(qiáng)峰峰面積差異率

2.4 含藥血清指紋圖譜相似度比較 以SBEE液含藥血清指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，利用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦值與歐氏距離測度方法，按公式(4)、(5)、(6)，分別計(jì)算不同方法提取液含藥血清指紋圖譜的相似度，SBEE液含藥血清指紋圖譜與其他3種之間的差別大小依次為：WE>AE>SBE，見表2。

表2 含藥血清指紋圖譜相似度比較

3 討論

在進(jìn)行采血時間優(yōu)選預(yù)實(shí)驗(yàn)中，給藥2 h后采血的指紋圖譜出現(xiàn)的色譜峰數(shù)最多，總面積最大，故本研究的給藥后采血時間確定為2 h。在進(jìn)行血清沉淀劑優(yōu)選預(yù)實(shí)驗(yàn)中，與乙腈比較，甲醇沉淀后內(nèi)源性雜質(zhì)少，故確定甲醇為本研究采用的沉淀劑；結(jié)果同時顯示4倍體積量甲醇可除去大部分雜質(zhì)，故確定甲醇的用量為全血體積量的4倍。

本研究對半夏白術(shù)天麻湯4種方法提取液(SBEE液、SBE液、WE液、AE液)≤1000 Da小分子混合物的含藥血清HPLC指紋圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果顯示：SBEE液含藥血清指紋圖譜有19個特征指紋峰，SBE液含藥血清少3個特征指紋峰(8、14、15)，WE液含藥血清少3個特征指紋峰(8、11、15)；AE液含藥血清少2個特征指紋峰(5、14)。SBE液、WE液、AE液各個含藥血清指紋圖譜特征峰總面積與SBEE液的含藥血清指紋圖譜特征峰總面積比值分別為0.8984、0.5236、0.8495。峰總面積大小順序?yàn)镾BEE>SBE>AE>WE，說明SBEE法更有利于機(jī)體吸收該方提取液中的成分。用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦測度與歐氏距離測度方法檢測4種方法提取液含藥血清指紋圖譜相似度，本研究結(jié)果顯示，3種測度結(jié)果一致，SBE液與SBEE液所含成分最相近，且SBE液提取率僅次于SBEE液。

綜上所述，與SBE法、AE法、WE法比較，SBEE法提取液的含藥血清指紋圖譜的特征峰最多，總峰面積最大，SBEE法更有利于機(jī)體吸收半夏白術(shù)天麻湯提取液中的成分。