調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者手術(shù)及化療前后外周血中的變化及意義

沈軍權(quán)，張汝一，甄運(yùn)寰，修 瑾

(1.余姚市人民醫(yī)院，肛腸外科，浙江 余姚 315400；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肛腸外科，貴州 貴陽 550004)

結(jié)直腸癌是現(xiàn)代社會最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性中排第3位，在女性中排第2位[1]，儼然已成為了一個世界性的社會公共問題。在近一個世紀(jì)中，外科手術(shù)作為CRC主要治療手段，其5年生存率長期徘徊在50%左右[2]。隨著腫瘤免疫機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]，極大地豐富了人類對于腫瘤免疫逃逸機(jī)制的認(rèn)識，為腫瘤生物治療療效不佳提出了新的解釋，也為腫瘤的治療提供了新的思路。近年來國內(nèi)外的Treg研究主要集中在腫瘤組織及外周血中的表達(dá)，但對腫瘤患者——特別是CRC患者，手術(shù)及化療后Treg的變化與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性研究較少報道。本文從CRC入手，進(jìn)一步研究手術(shù)及化療后Treg的變化特點及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 病例選擇 選取2015年5月—2016年1月在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的CRC患者，均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前有病理活檢結(jié)果證實為CRC；(2)影像學(xué)排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)入院前未進(jìn)行過放化療或生物治療；(4)均擬行原發(fā)灶根治性切除術(shù)；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期有感染、疫苗接種病史；(2)乙肝、丙肝、梅毒、HIV陽性；(3)合并有結(jié)直腸腺瘤；(4)合并有血液系統(tǒng)疾病或其他部位腫瘤；(5)有自身免疫系統(tǒng)疾病或近期使用過免疫抑制劑；(6)有嚴(yán)重心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全患者；(7)懷孕或哺乳期患者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重手術(shù)并發(fā)癥；(2)術(shù)后化療出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，化療不能持續(xù)者；(3)術(shù)后自行放棄化療者及不按期參與化療者。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 入組患者臨床資料 入選經(jīng)結(jié)腸鏡及活檢結(jié)果證實為CRC的初治患者15例為觀察組，其中男9例，女6例；年齡37～70歲，平均56.13±8.98歲；腫瘤部位：直腸7例，結(jié)腸8例；癌細(xì)胞分級：低級別4例，高級別11例；侵潤深度：T10例，T21例，T311例，T43例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)：N08例，N14例，N23例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)：M(-)15例，M(+)0例；TNM分期：I期1例，II期7例，III期7例，V期0例。術(shù)后2周開始予以“5-Fu”為基礎(chǔ)的三周方案進(jìn)行化療(癌細(xì)胞分級參照2010 版WHO結(jié)直腸癌組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)。TNM分期是參照2010年第七版AJCC癌癥分期手冊)。

1.3 對照組選擇 選取14例同期在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院健康中心參加體檢的健康者作為對照組，其中男6名，女8名，年齡41～68歲，平均51.71±9.17歲。其中外周血中免疫及生化指標(biāo)未見異常，既往無腫瘤手術(shù)史、息肉切除史、傳染病史及自身免疫系統(tǒng)疾病史。

1.4 檢測

1.4.1 主要實驗試劑及實驗器材 CD4-FITC 、CD25-ECD 、鞘液來自美國貝克曼庫爾特公司。FoxP3-PC7來自美國eBioscience公司。溶血劑來自美國BD公司。PBS(磷酸鹽緩沖液)自制。流式細(xì)胞儀(型號：FC500)來自美國貝克曼庫爾特公司。

1.4.2 標(biāo)本采集及檢測 采集健康者體檢當(dāng)天的清晨空腹靜脈血2 mL，分成兩管，用EDTA-K2抗凝管收集，當(dāng)天送檢；同法采集CRC患者術(shù)前1天、術(shù)后2周、術(shù)后10周(第2次化療后2周)的外周血液樣本。用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T淋巴細(xì)胞中的構(gòu)成比，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察患者與健康者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T淋巴細(xì)胞中的構(gòu)成比，對比患者手術(shù)前后相關(guān)炎癥指標(biāo)(IL-6、CRP、WBC)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所得實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理，應(yīng)用GraphPad Prism5.1軟件進(jìn)行作圖，計量資料數(shù)據(jù)均采用Mean±SD表示；兩組間比較用t檢驗，三組及以上比較用ANOVA分析，相關(guān)性用Pearson檢驗；P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中Treg表達(dá)情況 在CRC患者外周血中，CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例為(6.92±2.12)%，健康者為(4.66±0.92)%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；見圖1。不同年齡、性別、腫瘤部位、癌細(xì)胞分級、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分期的CRC患者間，其外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

Healthy為健康對照組，pre-operation為腫瘤組術(shù)前，post-operatioan為腫瘤組術(shù)后，post-2nd- chemo為腫瘤組術(shù)后行2周期化療后圖1 CRC患者和健康者外周血中Treg的表達(dá)水平

臨床病理特征例數(shù)CD4+CD25+Foxp3+TregP年齡(歲)≤5677.97±2.56>5686.00±1.130.07性別男97.02±1.17女66.77±3.210.86腫瘤部位直腸77.31±2.55結(jié)腸86.56±1.760.52癌細(xì)胞分級低級別117.10±2.09高級別46.43±2.430.68淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N=087.05±2.94N=146.58±0.74N=237.03±0.580.94TNM分期Ⅰ-Ⅱ87.05±2.94Ⅲ-Ⅳ76.77±0.580.80

2.2 手術(shù)及化療對Treg的影響 術(shù)前，CRC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例為(6.92±2.12)%，手術(shù)后為(6.69±2.15)%，經(jīng)“5-Fu”為基礎(chǔ)的三周方案進(jìn)行2周期化療后為(7.14±1.99)%，手術(shù)前后及化療前后均無顯著變化(P>0.05)，見圖1。

2.3 手術(shù)前后相關(guān)炎癥指標(biāo)變化結(jié)果 術(shù)前IL-6(4.81±5.46 pg/L)、CRP(5.82±11.40 mg/L)、WBC(6.20±1.80 G/L)與術(shù)后第1天(76.42±75.46 pg/L、71.68±35.77 mg/L、14.58±4.54 G/L比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后2周均降至術(shù)前水平。

3 討論

Treg是一群具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，目前已經(jīng)確定CD4+CD25+為其主要表型，且只有具備Foxp3表達(dá)的細(xì)胞才是Treg[5]。Treg是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，有免疫抑制性及免疫無能性[6-7]。這些作用對于其維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，在肺癌、卵巢癌等腫瘤患者的外周血Treg顯著高于健康者，腫瘤局部Treg數(shù)量較周圍正常組織亦明顯增加，且腫瘤切除后Treg恢復(fù)到正常水平，腫瘤復(fù)發(fā)時Treg也同樣增多；提示Treg參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且數(shù)量與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。在結(jié)直腸癌方面，Ling等[10]研究發(fā)現(xiàn)Treg在CRC患者外周血比例顯著高于健康者，同時在自體的腫瘤組織中Treg數(shù)量較非惡性大腸組織明顯增高，亦證明Treg參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展。但國內(nèi)外對CRC患者經(jīng)手術(shù)及化療后，隨著腫瘤負(fù)荷的減輕，外周血中Treg會發(fā)生怎樣變化，是否與預(yù)后呈正相關(guān)，卻鮮有報道；且以往由于對Treg定義不明確，大多研究主要集中于CD4+CD25+Treg的研究。本實驗我們從Treg的特異轉(zhuǎn)錄因子Foxp3入手，分析Treg在腫瘤患者手術(shù)及化療前后外周血中的變化及意義。

Treg在正常人體的外周血中以一定的比例存在，以維持機(jī)體的免疫平衡，但到目前為止，仍未進(jìn)行大規(guī)模普查，尚未有統(tǒng)一的參照標(biāo)準(zhǔn)。本實驗采集14位健康體檢者的外周血，測得CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例(4.66±0.92)%，與其他文獻(xiàn)報道相符[11]，可以作為對照基礎(chǔ)進(jìn)行下一步研究。在研究中我們發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例較健康對照組是顯著升高的，與國外研究相符[12-13]，說明CRC跟其他腫瘤一樣，確實存在Treg產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。同時分析發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+Treg在外周血中的表達(dá)水平與患者的年齡、原發(fā)腫瘤部位、癌細(xì)胞分級、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)(見表1)，與Shen等[14]報道一致，說明該研究尚不能肯定外周血Treg對預(yù)后的直接意義。

進(jìn)一步對CRC患者手術(shù)后2周、10周(術(shù)后第2次化療結(jié)束后2周)的外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg進(jìn)行縱向分析，發(fā)現(xiàn)Treg并沒有隨著腫瘤負(fù)荷的減少而明顯下降(見圖1)。對比其他腫瘤，如乳腺癌、肺癌等，國內(nèi)外研究報道術(shù)后2周，外周血中Treg出現(xiàn)明顯下降?？紤]可能腫瘤部位不同、手術(shù)創(chuàng)傷不同、引起全身炎癥反應(yīng)及抗炎反應(yīng)不同。Treg在炎癥反應(yīng)中，被誘導(dǎo)增值，通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子、接觸抑制劑競爭細(xì)胞因子等產(chǎn)生抑制炎癥作用[15]，從而保護(hù)人體避免遭受過度炎癥因子的損害。本實驗對CRC患者手術(shù)前后外周血中炎癥指標(biāo)IL-6、CRP、WBC檢測發(fā)現(xiàn)，雖術(shù)后2周炎癥因子基本恢復(fù)至術(shù)前水平，但機(jī)體免疫功能可能仍處于不穩(wěn)定或失衡狀態(tài)，故CD4+CD25+Foxp3+Treg沒有隨著腫瘤負(fù)荷的減低而下降。術(shù)后10周，外周血Treg仍未明顯下降；而Gareth Betts等[13]對58例CRC患者術(shù)后3個月、6個月、12個月進(jìn)行跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)外周血中Treg術(shù)后3個月明顯下降，12個月下降至正常水平；但這58例CRC患者均未參加術(shù)后化療，從中提示化療具有一定免疫調(diào)節(jié)功能，抑制了機(jī)體的免疫功能?；熓且环N全身性治療手段，對腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大殺傷力，對原發(fā)、殘留、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移的細(xì)胞均有殺傷作用，但同時其也有藥物選擇性不強(qiáng)的缺點，對全身其他細(xì)胞也可造成不同程度的損害。因本實驗未對CD4+T細(xì)胞及Treg的絕對數(shù)量進(jìn)行檢測，故無法證明化療是否導(dǎo)致Treg絕對數(shù)量的下降，但Treg在外周血中比例較術(shù)前無明顯變化，提示其免疫功能仍受抑制。

從本實驗中我們大膽推測，術(shù)后早期可能是生物免疫治療的最佳時間；過去我們的生物免疫治療效果不佳，是因為患者大多已屬腫瘤晚期，往往是其他治療如手術(shù)、化療無法取得效果的狀態(tài)下，繼而求助于生物治療，但遺憾的是目前尚未見此方面的大量文獻(xiàn)報道。我們下一步將對聯(lián)合檢查多種免疫活性細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD8+CD28+/CD28-細(xì)胞、Treg以及一系列正負(fù)血清細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β、IL-12、IFN-γ)，更深入研究結(jié)直腸癌患者的手術(shù)前后免疫功能變化，從而探討術(shù)后生物治療的最佳時間，為建立新的免疫功能綜合療效評價奠定基礎(chǔ)。