產ε-聚賴氨酸白色鏈霉菌的誘變育種

2019-01-03 07:19:34尤麗新胡楠楠孫永杰

現代食品 2018年20期

◎ 尤麗新，胡楠楠，班碩，孫永杰

（1.長春科技學院生物食品學院，吉林長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

食品在儲藏過程中常用化學防腐劑防腐保鮮，但會出現致癌中毒現象,所以人們更傾向于天然防腐劑。目前天然抗菌防腐劑主要有植物源、動物源、微生物源抗菌防腐劑，目前微生物防腐劑主要有溶菌酶、乳酸鏈球菌素、納他霉素、紅曲素及ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸是一種廣譜抑菌劑，能夠抑制革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、真菌和一些耐熱性芽孢桿菌等，安全性能高，可以用于多種食品的保鮮。本試驗在確定實驗室購買的白色鏈霉菌具有合成ε-聚賴氨酸能力的基礎上，對菌株進行紫外線誘變育種，以提高產物產量[1-4]。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

白色鏈霉菌（Streptomyces albulus），實驗室購買菌種，具有產ε-聚賴氨酸的能力。

1.1.2 試劑

酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、瓊脂粉、蛋白胨、甲基橙、誘惑紅、ε-聚賴氨酸、亞甲基藍、碘和次硝酸鉍等[5]。

1.1.3 溶液

① 0.7 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH=6.9）。②1 mmol·L-1甲基橙試劑。③生理鹽水（0.85%）。④改良的碘化鉍鉀試液。⑤碘化鉀-碘試液。

1.1.4 實驗儀器

分析天平、電子天平、顯微鏡、冰箱、培養箱、離心機、凈化工作臺、鼓風干燥箱、酸度計、振蕩器、紫外可見分光光度計和壓力蒸汽滅菌器。

1.1.5 培養基

①高氏一號培養基。②貝特納培養基。③液體發酵培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌體活化

采用高氏一號斜面培養基進行菌體活化，活化后菌株于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 分離純化菌種

取活化后的斜面種子一環，接種于斜面培養基（貝特納培養基），培養溫度30 ℃，培養6～7 d。

1.2.3 誘變育種[6-8]

（1）單孢子菌懸液的制備。待分離純化斜面菌種孢子成熟鋪滿斜面，用0.85%的無菌生理鹽水清洗孢子，調整孢子濃度為108個/mL（顯微鏡涂片計數法）。

（2）樣品的稀釋。將單孢子懸液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5以及 10-6系列稀釋菌液，選擇 10-3、10-4、10-5稀釋度，分別做平板接種培養及誘變處理。

（3）紫外誘變處理。打開紫外燈預熱20 min，培養皿里放入轉子，分別吸取菌懸液9 mL移入無菌培養皿中，將帶有菌懸液的培養皿放置在距15 W紫外燈下30 cm處，打開磁力攪拌器，開始計時，邊攪拌邊照射，照射時間分別為15、25、35、45 s以及55 s，照射完畢，關閉紫外燈。所有操作必須在紅燈下進行。取稀釋度10-3、10-4、10-5（分別經過 15、25、35、45 s以及 55 s誘變處理）各0.1 mL移入貝特納平板上，用無菌玻璃涂布棒涂布均勻，然后30 ℃、避光條件下培養72 h后進行菌落計數。

（4）計算存活率和致死率。對培養后的平板進行菌落計數。以對照組平板菌落數為基準，計算出經紫外處理15、25、35、45 s以及55 s后每毫升菌液中的活菌數和致死率。

1.2.4 突變菌株初篩

亞甲基藍是一種堿性染料，而菌體會分泌產生帶正電的產物ε-聚賴氨酸，由于靜電作用，會排斥亞甲基藍，進而菌體周圍會形成藍色較淺的透明圈。所形成的透明圈的直徑與菌體直徑比值（HC值），與對照平板進行比較，一般HC值越大，則說明ε-聚賴氨酸產量越大；HC值越小，則產量越小。可將HC比值作為鑒定高產ε-聚賴氨酸菌株的指標[9]。

1.2.5 突變菌株搖瓶發酵（復篩）

分別將原菌株與經誘變初篩的菌株接入裝有40 mL發酵培養液的250 mL三角瓶中，在空氣浴震蕩器培養72 h，溫度 30 ℃，轉速 200 r·min-1。

1.2.6 ε-聚賴氨酸含量的測定

用分光光度計測定ε-聚賴氨酸的含量，參照Itzhak和Shima甲基橙比色法。以磷酸緩沖液為空白樣，在465 nm下測定樣品吸光度，以A465為縱坐標，ε-聚賴氨酸含量為橫坐標，繪制ε-聚賴氨酸標準曲線。

將誘變前后菌株進行搖瓶發酵3 d后，發酵液經過處理，稀釋20倍后測定OD425值，最后根據標準曲線計算出發酵液中ε-聚賴氨酸的含量。