大豆過敏原檢測研究

◎ 趙小明

（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040）

大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]屬于豆科植物的一種，數千年來一直被人類當作食物來食用。大豆中含有很多營養物質，約含有蛋白質39%，其中，部分是過敏原成分，如甘氨酸m3、m4，大豆球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。

大豆產品廣泛應用于食品工業，作為增稠劑、乳化劑和蛋白填充機。對大豆過敏的人群必須嚴格避免食用大豆或含有大豆的食物。在食品生產加工過程中由于交叉污染會造成大豆殘留在食物中很難排除，因此高靈敏度的檢測方法對于大豆食品檢測必不可少[1]。

1 檢測原理

大豆檢測試劑盒應用夾心法酶聯免疫吸附原理（ELISA），提取緩沖液萃取的大豆蛋白與包被在微孔表面的大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）抗體反應。樣品提取液或標準品加入到抗體包被的微孔中，大豆胰蛋白酶抑制劑將會結合到抗體上，經過一次洗板之后將大豆胰蛋白酶抑制劑抗體酶聯偶合物加入到微孔上進行孵育培養。第二次洗板之后將酶底物加入，顏色變為藍色。且顏色深淺與樣品或標準品中大豆胰蛋白酶抑制劑含量成正比。加入反應終止液終止反應后，反應液顏色應由藍色轉為黃色。在450 nm（OD450）濾鏡及630 nm示差濾鏡下使用酶標儀測量微孔板吸光度值。以標準品吸光度值對標準品濃度制作標準曲線，將樣品吸光度值與標準品吸光度值比較進行結果判讀。

2 注意事項

注意事項如下：①試劑盒不使用時需放置在2～8 ℃保存，并確保在有效期內使用。②嚴格遵守說明書中注明的操作時間進行孵育，否則將導致實驗結果不精準。③為了避免交叉污染，樣品制備前必須將所有儀器徹底清洗。④反應終止液中含酸，避免直接接觸皮膚及眼睛。若不小心濺到，及時用水沖洗。⑤在實驗中應當自始至終穿戴橡膠手套、安全眼鏡及實驗外套。⑥檢測完后需對所有材料、容器及設備作適當處理。

3 試劑準備

試劑準備如下：①提取緩沖液；用去離子水按照1∶10的比例稀釋濃縮提取緩沖液，配制好的稀釋緩沖液儲存在4 ℃條件下，可以穩定保存1周。②清洗緩沖液；緩沖液放在冷凍條件下儲存將會有晶體狀沉淀，濃縮的緩沖液需要回溫使其完全溶解，然后再與去離子水按照1∶10的比例稀釋。配制好的稀釋緩沖液儲存在4 ℃條件下，可以穩定保存1周。

4 操作步驟

操作步驟如下：①獲取具有代表性的樣品，取5 g樣品放在勻漿機或攪拌器上磨碎混勻。②稱取1 g混勻樣品，與20 mL稀釋提取緩沖液渦旋混勻。③在60 ℃水浴鍋中孵育15 min，每2 min充分振蕩混勻一次。④2 000 r·min-1，離心10 min獲得上清液，如果上清液中仍有顆粒物質，需要重新過濾上清液收集濾液；或者直接用濾紙過濾提取液，收集濾液準備檢測。⑤測試樣品的準備。取無顆粒上清液100 μL于孔中進行檢測，如果樣品中的過敏原含量超出定量范圍，需要增加稀釋比例，在計算樣品中的濃度時需要將額外的稀釋比例考慮在內。

5 檢測流程

檢測流程如下；在使用前，所有試劑及試劑盒內的材料必須恢復至室溫（18～30）℃。建議若使用8道移液槍進行操作，在一次試驗中樣品及標準品的總量不超過48個（6條微孔）；若使用單道移液槍進行操作，在任何一次實驗中樣品及標準品的總量不要超過16個（2條微孔）。①將等量有抗體包被的微孔條放入微孔板架上，未使用的有抗體包被的微孔條需放回裝有干燥劑的原鋁箔袋內并密封保存。②使用單道移液器吸取準備好的樣品或者標準品100 μL于抗體微孔中，每移取一個標準品或樣品，單道移液槍必須更換新吸頭。注意確保最后將吸頭中的液體排空。③室溫條件下孵育20 min，不要搖動微孔板，以免引起孔與孔之間的污染。④將孔中的液體甩入水槽中，用300 μL沖洗緩沖液沖洗每個孔，然后將微孔中的水甩入水槽中。如此反復沖洗3次。注意：在沖洗過程中不要將微孔條從微孔板架上取下，每條微孔條帶應被固定在微孔板架上。⑤第3次洗板完畢后，將幾張吸水紙巾放置在平整的桌面上，使微孔板倒置扣在紙面上，以盡可能地將殘留的水分排出。用干布或紙巾擦干微孔板底反面的水珠。⑥按照約120 μL/孔或1 mL/條的體積計算所需的酶聯偶合物用量。從綠色瓶蓋的瓶內量取所需用量的酶聯偶合物至另外一個獨立的容器中（例如適用于8道移液槍的試劑槽中），移取100 μL酶聯偶合物至每個微孔中。⑦按照120 μL/孔或1 mL/條的體積計算所需的底物用量。從藍色瓶蓋的瓶內量取所需用量的酶底物至一個底物試劑槽中（例如適用于8道移液槍的試劑槽中），移取100 μL酶底物至每個微孔中，室溫避光孵育20 min。⑧按照120 μL/孔或1 mL/條的體積計算所需的終止液用量。從紅色瓶蓋的瓶中量取所需用量的終止液至一個終止液試劑槽中（例如適用于8道移液槍的試劑槽中），依序（順序與加入底物的順序相同）向每個微孔中加入100 μL終止液終止反應。顏色應由藍變黃。⑨用酶標儀在450 nm濾鏡及示差濾鏡630 nm下讀取結果，記錄每個微孔的吸光度OD值。在讀取數據前，微孔中應沒有氣泡，否則將影響分析結果。

另需注意：不能將任何未使用的或用剩的試劑倒回原裝瓶中。檢驗過程中應分清樣品與標準品的位置。且在整個檢驗過程中，任何時候都不允許搖動微孔板以混合孔內液體。

6 結果判讀

直接用標準品的吸光度值或者用相對于1 000 μg·kg-1標準品的吸光度值的百分數建立5個標準品的標準曲線。由于各標準品中的大豆胰蛋白酶抑制劑含量已知，則未知樣品大豆胰蛋白酶抑制劑的濃度即可通過此標準曲線獲得。結果也可通過RomerLog/Logit軟件計算得出，如果使用Log/Logit軟件計算結果，其標準曲線的線性相關系數不得低于0.985，若標準品1 000 μg·kg-1的吸光度值低于0.7，即表示試劑已變質，請勿繼續使用；若樣品所含大豆胰蛋白酶抑制劑濃度高于標準品的最高濃度（＞1 000 μg·kg-1），則需將提取過濾的溶液利用更多的提取緩沖液稀釋到試劑盒檢測范圍40～1 000 μg·kg-1以內，重新檢測以得到精確結果。在最后的結果計算中，注意要將稀釋倍數算入。

此試劑盒是用于對樣品中大豆胰蛋白酶抑制劑的測定，而大豆胰蛋白酶抑制劑只是大豆蛋白的一種，若要進行其他特殊蛋白產品的測定可參考表1的驗證數據。

表1 大豆衍生品中大豆產品含量的測量參考數據表

7 檢測結果

選取本公司所生產的可能含大豆過敏原的品種原料以及生產設備、清潔洗滌水進行檢測（試劑檢出限：0.24 mg·kg-1），其結果如表 2。

表2 可能含有大豆過敏原的樣品檢測表

通過檢測證明湯臣倍健股份有限公司產品所含大豆過敏原是合格的，不會給一般食用人員帶來潛在危害。

8 結語

通過對食品或保健食品中所含大豆過敏原的檢測，能夠提前發現食品安全風險，防止給具有此類過敏體質的食用人群帶來安全風險。