醋酸桿菌輔助酶解法提取動物軟骨中硫酸軟骨素的研究

◎ 鄒德生，谷 昊

（鞍山師范學院化學系，遼寧 鞍山 114005）

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一種酸性黏多糖，純品為白色或淡黃色粉末，易溶于水不溶于有機溶劑，在動物軟骨中含量豐富，具有促進軟骨再生、預防角膜炎、抗血栓、調節血脂、抗感染，增強免疫功能抗腫瘤等生物學活性，可應用于臨床藥物與保健食品[1]。近年來，市場對硫酸軟骨素的需求不斷加大，呈現供不應求的局面[2]，我國是硫酸軟骨素出口第一大國，但我國企業多采用濃堿浸提法生產，此方法存在得率低、純度低、污染大、成本高等問題[3]，因此探索硫酸軟骨素新的生產技術，減少生產成本和對環境的污染，提高產品得率和純度，具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

（1）實驗材料。豬、羊喉管軟骨，購自學校周邊屠宰場。

（2）實驗試劑。醋酸桿菌，實驗室自有；堿性磷酸酶、木瓜蛋白酶，購自廈門泰金生物技術有限公司；硫酸軟骨素標準品，購自SIGMA公司；其他材料均為分析純。

1.2 實驗儀器

粉碎機FZ125（天津泰斯特儀器有限公司）、HH4數顯水浴鍋（國華儀器有限公司）、干燥箱ZB101（國華儀器有限公司）、離心機D-04B（日本東芝公司）、TU-1900紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、冷凍干燥機SCIENTZ-120（寧波新知生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 軟骨預處理

取豬、羊軟骨置于鍋內煮沸約30 min，剔除雜質后粉碎，過篩后備用。

2.2 硫酸軟骨素提取

取醋酸桿菌接種于200 g軟骨粉中，于發酵罐中在35 ℃下處理24 h，取出后于95 ℃水浴滅活10 min。冷卻后調節pH至10.5，加入一定濃度的堿性蛋白酶于37 ℃恒溫處理數小時。再調節pH至6.4，加入木瓜蛋白酶于37 ℃水解數小時，后于80 ℃水浴滅活10 min。在4 ℃ 12 000 r·min-1離心 5 min后在上清液中加入活性炭低溫靜置2 h，用MNWC 6000中空纖維超濾器過濾[4]。在濾液中加入無水乙醇沉淀，真空干燥后即得硫酸軟骨素純品。

2.3 硫酸軟骨素含量測定

采用間苯三酚法測定硫酸軟骨素含量[5]，取硫酸軟骨素標準品配制成20 mg·mL-1的溶液，分別取0.2、0.4、0.6、0.8 mL和 1.0 mL放于 10 mL容量瓶中，加間苯三酚3 mL并加水1 mL，在廢水浴中放置30 min，去除冷卻后加冰醋酸至刻度，于558 nm波長處測定吸光度，并繪制標準曲線。

2.4 硫酸軟骨素純度測定

采用瓊脂糖電泳法測定硫酸軟骨素純度[6]，配制0.75%的瓊脂糖凝膠，以硫酸軟骨素標準品為對照，每孔加30 μL提取液，用pH 8.6的電泳緩沖液電泳，電壓150 V，電泳時間1.5 h。電泳完畢后染色，掃描后用BandScan軟件分析純度。

3 結果與分析

由于硫酸軟骨素多糖與蛋白交聯，研究表明溫度超過60 ℃時，就會開始分解[7]，所以如長時間高溫處理會影響產品純度與收率，所以本實驗采用醋酸桿菌和各種酶類的最適溫度和最適pH，對醋酸桿菌濃度，堿性蛋白酶濃度和木瓜蛋白酶濃度3個因素進行了單因素實驗。

3.1 硫酸軟骨素含量的標準曲線

結果表明，硫酸軟骨素濃度在0.1～1.0 mg·mL-1時，吸光度與濃度成正相關，如圖1所示，相關方程為 y=0.664 9x-0.005 4，R2=0.998 9。

圖1 硫酸軟骨素含量的標準曲線圖

3.2 醋酸桿菌濃度對提取率的影響

醋酸桿菌具有強力分解蛋白質的功能，可以用于分解軟骨中的蛋白質成分。在6個小型發酵罐中分別加入200 g軟骨粉，加入不同濃度的醋酸桿菌，濃度分別為 4、5、6、7 g/100 mL和8 g/100 mL，在 35 ℃下處理24 h，結果如圖2所示。由實驗結果可知，醋酸桿菌的最佳濃度為6 g/100 mL，繼續增大醋酸桿菌濃度得率沒有顯著增加。

圖2 醋酸桿菌濃度對提取率的影響圖

3.3 堿性蛋白酶濃度對提取率的影響

查閱使用手冊可知，此堿性蛋白酶的最適pH為11。取5個三角燒瓶，在發酵液中分別加入質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的堿性磷酸酶，在37 ℃，pH為11下酶解4 h，結果如圖3所示。由實驗結果可知，堿性磷酸酶的最佳濃度為1.5%，如繼續增大酶濃度，得率不會繼續增大。

圖3 堿性蛋白酶濃度對提取率的影響圖

3.4 木瓜蛋白酶濃度對提取率的影響

查閱木瓜蛋白酶使用手冊可知，此酶最適pH為6.5。取5個三角燒瓶，在發酵液中分別加入質量分數為0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的木瓜蛋白酶，在37 ℃，pH為6.5的條件下酶解4 h，結果如圖4所示。由實驗結果可知，木瓜蛋白酶的最佳濃度為1.5%，繼續增大酶濃度，產率下降，這可能是由于在酶濃度過高時，酶活力無法完全發揮反而成為一個雜蛋白而降低了得率。

圖4 木瓜蛋白酶濃度對提取率的影響圖

3.5 硫酸軟骨素的純度分析

經瓊脂糖凝膠電泳后，得凝膠掃描圖如圖5，電泳圖從左至右依次為標準品孔道，空白對照孔道，3次提取液樣品孔道。由圖5可知，試驗中提取到的樣品分子質量與標準品一致，在樣品提取液孔道上方和下方有少量雜蛋白條帶存在，經凝膠分析軟件BandScan軟件分析可知，樣品純度達到92.77%，已經可以滿足出口要求。

圖5 硫酸軟骨素瓊脂糖凝膠電泳圖

4 結論

本實驗研究了采用醋酸桿菌輔助酶解法提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件，結果表明在醋酸桿菌濃度6 g/100 mL，發酵溫度35 ℃；堿性蛋白酶濃度1.5%，酶解時間4 h；木瓜蛋白酶濃度1.5%，酶解時間4 h，在此條件下硫酸軟骨素提取為7.65%，純度為90.77%。由結果可知，相比于目前廣泛采用的濃堿浸提法，本法的硫酸軟骨素產率比濃堿浸提法稍低，但是純度遠高于濃堿浸提法，而且本法具有成本低，操作簡便，對環境污染小等優點。