蠟樣芽胞桿菌鑒定方法研究

◎ 蘇佩冰，梁梅娟，陳靖欣，殷 歡

（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

蠟樣芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性芽孢菌，呈桿狀，大小為（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，可在菌體內形成圓形或橢圓形芽孢[1]。蠟樣芽孢桿菌普遍分布在水、土壤、空氣中，極易污染食品[2]。被蠟樣芽孢桿菌污染的食品在室溫下放置，細菌繁殖較快，達到一定量并食入后會產生腸毒素。由于該菌從外觀、氣味上無顯著變化，食入后會引起食源性疾病即食物中毒[3]。且其在乳品、豆制品、剩米飯、肉制品、干制品（奶粉、面粉）等淀粉含量較高的食物中污染較重。因此，常被作為主要監測的食源性致病菌之一[4]。

目前，對于蠟樣芽孢桿菌的鑒定方法主要有生化鑒定方法、Riboprinter核糖體分型法、VITEK2 Compact、API50 CHB檢測法等。本文對這4種方法進行研究，看是否能鑒定出蠟樣芽孢桿菌與其類似菌。

1 材料與方法

1.1 菌株

蠟樣芽孢桿菌標準菌[CMCC（B）63303]、蕈狀芽孢桿菌標準菌（ATCC 10206）、蘇云金芽孢桿菌標準菌（ATCC 10792）、可疑菌。

1.2 實驗的生化試劑及培養基

營養瓊脂、過氧化氫溶液、酪蛋白瓊脂、TSSB、瓊脂硫酸錳營養瓊脂、革蘭氏染液、0.5%堿性復紅、蠟樣芽孢桿菌生化試劑盒。

1.3 鑒定方法

1.3.1 GB 4789.14-2014

生化鑒定通過革蘭氏染色、過氧化氫酶、酪蛋白分解實驗、生化鑒定試劑盒[動力實驗、硝酸鹽還原實驗、溶菌酶耐性實驗、V-P實驗、葡萄糖利用（厭氧）實驗]、根狀生長實驗、溶血實驗、蛋白質毒素結晶實驗。1.3.2 VITEK 2 Compact檢測方法

VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統把細菌必須的生化反應培養基固定在卡片上，培養后通過卡片的顯色讀取到系統中[5]。用BCL卡將3種標準菌和可疑菌上機，14.25 h后通過電腦讀取結果。

1.3.3 API50 CHB檢測方法

API 50 CH是采用50個生化實驗對微生物的碳水化合物的代謝進行研究。API CH與API CHB培養基配合使用，用以鑒定芽孢桿菌及相關細菌，腸桿菌科細菌和弧菌科細菌。按操作說明將目標菌制成菌懸液用API 50 CH試劑條和API 20E試劑條在30 ℃下培養24～48 h。再將結果錄入API 50 CHBV4.0鑒定軟件進行結果的判讀。

1.3.4 RiboPrinter核糖體分型方法

RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統基于核糖體分型技術，使用常用限制性內切酶（如EcoR Ⅰ、PvuⅡ、Pst Ⅰ等）消化目標菌基因組產生的基因片段，基因片段經過電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜上，與DuPont專門設計的DNA探針雜交，該探針編碼與16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA和間隔序列高度相似，雜交后通過化學發光原理產生的信號由相機捕獲傳至工作站產生“條形碼”狀條帶圖像（RiboPrinter 模式）基因指紋圖，將基因指紋圖與數據庫中的標準菌株基因指紋圖譜比較，達到細菌鑒定和分型的目的。檢測時按照操作規程挑取純菌落在緩沖液中加熱滅活，最后上機，通過8 h在機里的操作，得到鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 GB 4789.14-2014生化鑒定的結果

GB 4789.14-2014生化鑒定的結果見表1。

表1 蠟樣芽孢桿菌與類似菌生化鑒定表

革蘭氏染色在油鏡下觀察，可疑菌、蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌從形態結構上無太大區別，蕈狀芽孢桿菌呈長條狀。從表1可看出，10個生化實驗有8個實驗結果相同，只有根狀生長實驗和蛋白毒素結晶實驗能看到不一樣。在根狀生長實驗中，蕈狀芽孢桿菌在營養瓊之平板中呈毛玻璃似的根狀生長，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和可疑菌則呈融蠟狀、山谷狀生長[6]。在蛋白質毒素晶體實驗中，通過染色鏡檢觀察到蘇云金芽孢桿菌淺紅色的游離芽孢和深紅色的菱形晶體。從結果可知，僅僅依靠革蘭氏染色和8個生化實驗無法區分出三者，容易出現假陽性，因此只能作為輔助手段。根狀生長實驗可以有效鑒定蕈狀芽孢桿菌，蛋白質毒素結晶實驗則能有效鑒定蘇云金芽孢桿菌。

2.2 VITEK 2 Compact檢測的結果

VITEK 2 Compact檢測的結果見表2。

表2 蠟樣芽孢桿菌和類似菌VITEK 2結果表

表2結果顯示，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和可疑菌的鑒別中，無法準確鑒別是哪種菌，需要結合蛋白毒素結晶實驗、根狀生長實驗來鑒定蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。

2.3 API50 CHB檢測的結果

試劑條的結果只有蕈狀芽孢桿菌鑒定結果有90%以上，蠟樣芽孢桿菌、可疑菌和蘇云金芽孢桿菌無法鑒定出來。這種檢測方法可以準確的鑒定出蕈狀芽孢桿菌，但對于蠟樣芽孢桿菌的鑒定沒有太大幫助。

2.4 Riboprinter核糖體分型的結果

Riboprinter核糖體分型的結果見表3。

表3 蠟樣芽孢桿菌與類似菌Riboprinter核糖體分型表

目標菌經EcoRⅠ酶切與DNA探針雜交產生了清晰的指紋圖譜。從結果可知，Riboprinter核糖體分型方法可以鑒定出這4種菌，可疑菌的圖譜顯示該菌種是蠟樣芽孢桿菌可能性達到0.92。但由于實驗的數據較少，還需要通過生化實驗做進一步確認。

3 分析與討論

從4種方法的實驗結果可發現，蕈狀芽孢桿菌是比較容易鑒定的，可以通過形態，根狀生長實驗API 50 CHB將蕈狀芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、可疑菌區分開。但是蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌由于DNA結構相似，只有個別堿基對有差異[7]，在這4種方法中，并沒有任何一種可以簡單、高效的鑒定出兩者。一般都需要結合蛋白質毒素結晶實驗。API 50 CHB、VITEK 2 Compact、RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統基于核糖體分型技術檢測方法只能作為鑒定方法的輔助工具，最終還是需要結合根狀實驗和蛋白質毒素結晶實驗來完成確認。RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統基于核糖體分型技術檢測方法結合蛋白質毒素結晶實驗可高效快速的鑒定出蠟樣芽孢桿菌。

4 結論

在蠟樣芽孢桿菌的鑒定中，通過RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統基于核糖體分型技術檢測方法結合蛋白質毒素結晶實驗，以形態觀察和生化實驗為輔助手段，可提高蠟樣芽孢桿菌鑒定的準確性，降低假陽性、假陰性出現的概率，解決蠟樣芽孢桿菌難鑒定的問題。