GPC-GC-MS/MS同時測定含油食品中16種鄰苯二甲酸酯

◎ 袁荷芳，蔣曉勤，程 妍，倪嘉倩

（常州市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 常州 213000）

鄰苯二甲酸酯（縮寫PAEs），又稱酞酸酯，是鄰苯二甲酸形成的酯的統稱。PAEs是一類能起到軟化作用的化學品，它被普遍應用于玩具、食品包裝、乙烯地板、清潔劑、指甲油、噴霧劑和洗發水等很多產品中[1]。大量研究表明，PAEs及其代謝產物能夠對人體健康產生不利的影響[2-3]。歐洲安全局、美國、日本、中國也都先后將PAEs列入優先控制污染物的黑名單，PAEs對人類健康的危害已經引起世界的廣泛關注。目前，很多含油食品包裝都是使用的都是塑料包裝，由于塑化劑是脂溶性的，很容易遷移至食品中，造成污染。

有關PAEs測定方法主要有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[6]、液相色譜-串聯質譜法[7]等。凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）技術已廣泛用于去除油脂樣品中的脂質和色素等干擾物，氣相色譜/質譜法是目前對PAEs較為主要的檢測方法。本實驗將GPC與GC/MS技術相結合，研究了含油食品中16種PAEs的檢測方法，為進一步了解目前市場上含油食品中PAEs的污染情況，保護消費者健康有著重要的意義。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和試劑

色譜純環己烷（國藥集團化學制劑有限公司，批號：16080007）；色譜純乙酸乙酯（國藥集團化學制劑有限公司，批號：15030081）；色譜純甲醇（德國默克，批號：1826907614）；分析純丙酮（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160516）；1 000 mg·L-116種鄰苯二甲酸酯混合標樣，分別為鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基乙）酯、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2戊基）酯、鄰苯二甲酸二(2- 乙氧基己)酯、鄰苯二甲酸二戊酯、鄰苯二甲酸二己酯、鄰苯二甲酸芐丁酯、鄰苯二甲酸二（2-丁氧乙）酯、鄰苯二甲酸二環己酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯、鄰苯二甲酸二苯酯、鄰苯二甲酸二正辛酯和鄰苯二甲酸二壬酯，購于上海安譜。

1.2 標準溶液的配制

16種鄰苯二甲酸酯混合標樣濃度為1 000 mg·L-1，準確移取1 mL混標，用環己烷定容至25 mL，配制成40 mg·L-1儲備液。吸取一定量的儲備液，配制成0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1和 8.0 mg·L-1標準系列溶液。置于4 ℃冰箱中避光保存，有效期3個月。

1.3 實驗儀器

CP513電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；WT5002K電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WXH-3微型旋渦混合器2800次/分（上海躍進醫療器械廠）；Freestyle全自動凝膠滲透色譜-在線濃縮-SPE系統配套固相萃取儀（德國LCTech）；全自動固相萃取儀（睿科儀器有限公司）；7890A-7000GC-MS/MS氣相色譜-串聯質譜儀（安捷倫科技有限公司），配電子轟擊源（EI源）。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm；進樣方式：自動進樣；進樣量：1 μL；不分流；分流比：20∶1；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣流速：1 mL·min-1；進洋口溫度：250 ℃；柱溫箱溫度：60 ℃用于 1 min，然后 20 ℃·min-1到 220 ℃，保持1 min，然后5 ℃·min-1到280 ℃，保持4 min，總時間為30 min。

1.5 質譜條件

質譜：EI電離方式，電離能70 eV；碰撞氣：高純氮氣（99.999%）；GC-MS-MS接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描范圍m/z 50～450；掃描方式：多離子反應監測模式（MRM）；溶劑延遲5 min。

2 結果與分析

2.1 鄰苯二甲酸酯的提取方法的選擇

2.1.1 超聲提取法

準確稱取1.0～2.0 g（精確至0.000 1 g）含油試樣，加入色譜純環己烷10.0 mL，超聲提取10 min，靜置后將上清液全部轉移至玻璃試管中，40 ℃氮吹至近干，后用環己烷定容至1 mL，上GC-MS/MS進行測定，同時做試劑空白。實驗發現，超聲提取前處理方法不能有效去除雜質干擾，影響目標物的測定。

2.1.2 凝膠色譜凈化法

稱取0.5～1.0 g（精確至0.000 1 g）樣品于15 mL樣品瓶中，加入體積比為1∶1的乙酸乙酯、環己烷混合溶液10 mL，渦旋20 s，采用全自動凝膠色譜-在線濃縮-SPE系統配套固相萃取儀，用自動進樣器取5 mL稀釋后的樣品溶液注入GPC，凈化分離后，濃縮定容至2 mL，取1μL供GC-MS/MS分析，同時做試劑空白。

2.2 凝膠色譜凈化方法的優化

2.2.1 凝膠滲透時間的優化

稱取0.5 g食用油，加入16種鄰苯二甲酸酯混標，按樣品處理方法進行處理。將凝膠色譜柱流出端與濃縮器斷開，準備一個放廢液的燒杯收集預淋洗10 s，凈化分離除雜質800 s后產生的溶液，之后準備12個2 mL收集瓶收集720 s流出液，每60 s收集一份，即每份1 mL，共12份，再用GC-MS/MS測定。結果發現，第1份和第12份未檢出鄰苯二甲酸酯。所以最終確定凈化除雜質時間為720 s，主要收集時間720 s。

2.2.2 凝膠滲透溫度的優化

濃縮溫度直接影響了收集液的濃縮速度。研究比較了33、35、37、40、42 ℃和44 ℃對同一加標濃度回收率的影響，發現在33℃下濃縮的回收率較低，在45%以下。這可能是由于低的溫度使濃縮的時間過長，反而損失各組分的回收率。35 ℃和37 ℃下濃縮各組分的回收率明顯升高，兩個溫度沒有明顯差別。但隨溫度升高到42 ℃和44 ℃后，各組分回收率隨之降低。考慮到較高的溫度有機溶劑蒸發得快些，可以提高工作效率，故選擇40 ℃為最終濃縮溫度。

2.2.3 濃縮壓強的優化

濃縮腔的預濃縮壓強是指將收集液濃縮到5 mL這階段所用壓強，定容壓強為最后定容階段所用壓強，通常預濃縮壓強比定容壓強低5 kPa，本研究比較了20～ 22、22～ 24、24～ 26、26～ 28 kPa以 及28～30 kPa等不同預濃縮壓強-定容壓強組合對同一加標濃度回收率的影響，發現在隨壓強的升高，各組分回收率相應的提高，但當預濃縮壓強為22 kPa，定容壓強為27 kPa達到穩定，再升高壓強對大部分組分的回收率沒有影響，有的組分的回收率甚至出現降低，故選擇22 kPa為預濃縮壓強，27 kPa為定容壓強。

2.3 GC-MS/MS條件的優化

2.3.1 目標物母離子的選擇

通過一級質譜圖選擇豐度較大且相對分子質量適中的碎片離子作為母離子。鄰苯二甲酸二甲酯（m/z）163碎片離子峰相對豐度最大，鄰苯二甲酸二（2-甲氧基乙）酯（m/z）59碎片離子峰相對豐度最大，鄰苯二甲酸二（2-乙氧基己）酯（m/z）73碎片離子峰相對豐度最大，鄰苯二甲酸二苯酯（m/z）225碎片離子峰相對豐度最大。其余12種鄰苯二甲酸酯的所有碎片離子中（m/z）149的碎片離子峰相對豐度最大，因此其余12種鄰苯二甲酸酯均選擇（m/z）149作為母離子。然后從中選擇2～3個碎片離子作為子離子（即為定量離子），12種鄰苯二甲酸酯均選擇（m/z）93、65作為子離子。

2.3.2 定量離子及定性離子的選擇

三重四級桿可同時進行定性和定量分析，提供具體的分子量信息。一個母離子經過碰撞會得到一些子離子，而其中有比較穩定的，且峰度比較強的，可以選擇作為定量離子，同時它也可以是定性離子。因為一個定量離子對還不能達到定性的鑒定點數，所以再選擇兩個離子對作為輔助定性的離子。

2.3.3 目標物碰撞電壓的優化

三重四級桿串聯質譜在掃描過程中，一般選取m/z大、信號強的離子作為前級離子，產物離子則選擇前級離子裂解后產生的特征離子。本文分別通過全掃模式（scan）和產物離子掃描（Product-ion scan）確定組分的前級離子和特征產物離子，對前級離子生成產物離子過程中所需的電壓進行優化，找到最佳的碰撞能量。

對于三重四極桿掃描質譜，其掃描速度和掃描時間也是影響其掃描結果的重要的因素。當掃描速度加快時，單位時間內采集的點數會增多，色譜峰模擬狀況就越好，但掃描速度過快，相應的離子采集效率降低，噪聲會變大，重現性降低。每個色譜峰最佳質譜采集點數為10～15個點，根據色譜峰的峰寬除以質譜采集點數可以得到合適的質譜掃描時間，以確定多反應監測掃描（MRM）的參數。

2.4 空白干擾

在前處理過程和正常的色譜分析條件下，空白樣品中鄰苯二甲酸酯很可能出峰，分析其來源可能有3個方面：①樣品前處理操作過程中容器污染。②儀器管路污染。③進樣隔墊、樣品瓶隔墊及進樣針等引入污染。

針對以上原因，采用了如下3個步驟控制空白：①容器空白。實驗用到的所有器皿在每次使用之前均用色譜純環己烷清洗3遍。②采用體積比為1∶1的乙酸乙酯、環己烷混和溶劑清洗GPC管路。③采用超高惰性隔墊，工作曲線最高濃度點與樣品之間加2個溶劑樣品用于洗針。通過上述步驟，鄰苯二甲酸酯空白出峰問題得到了有效控制。

2.5 方法的評價

2.5.1 鄰苯二甲酸酯標準曲線、線性方程及相關系數

鄰苯二甲酸酯儲備液用環己烷稀釋，配制質量濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1和 8.0 mg·L-1的系列標準溶液，進行測定，以各目標化合物的質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，確定方法的線性范圍及相關系數R2。

2.5.2 方法準確度和精密度

將低、中、高不同質量濃度水平的混合標準溶液添加到空白樣中，分別制成100、1 000 μg·kg-1的加標樣品，同時做空白樣品實驗。每個水平平行做6次，回收率與相對標準偏差（RSD）結果見表1。

表1 樣品加標回收率及精密度表

續表1

3 實際樣品分析與討論

用本文建立的方法對市場上隨機抽查的50個食用油及含油樣品進行檢測，檢出4個陽性樣品。16種鄰苯二甲酸酯中檢出3種，分別是DIBP、DBP和DEHP，這3種化合物都是歐盟REACH法規高度關切物質清單中的化合物，是目前我國使用較為廣泛的增塑劑，陽性樣品檢出值見表2。

表2 陽性樣品檢出值表

歐盟令2007/19/EC和我國GB 9685-2008均規定了DBP和DEHP在食品中的特定遷移限量為1.5 mg·kg-1和0.3 mg·kg-1（目前DIBP還沒有限量規定），因此有3個樣品超過限量要求。出現這種情況有可能是原材料所處的生長環境空氣、灌溉水和土壤中含有鄰苯二甲酸酯類，整個采集、運輸、加工、儲藏過程中與含有鄰苯二甲酸酯類的塑料管道或其他環境相接觸，特別是儲藏容器和產品包裝中如果含有鄰苯二甲酸酯類，長時間接觸都很有可能把鄰苯二甲酸酯類遷移到含油食品中。

本研究采用凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯質譜法對含油中16種鄰苯二甲酸酯進行分析檢測。該方法在0～16 mg·kg-1范圍內具有良好的線性，相關系數R2在0.998 64～0.999 22。含油脂樣品中16種鄰苯二甲酸酯的加標回收率為84.85%～107.45%；方法檢出限為100～200 μg·kg-1，相對標準偏差（n=6）在2.0%～5.0%。本方法準確、穩定、簡便、重復性較好，該方法的準確度符合食品中痕量物質檢測要求，可應用于含油脂食品中16種鄰苯二甲酸酯的實際檢測分析。