試驗設計及其在中藥新藥研究中的應用

廖禹程 翁琰 石小鵬 孫蓮 文愛東（通訊作者）

（1 空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科 陜西 西安 710032）

（2 新疆醫科大學藥學院 新疆 烏魯木齊 830011）

中藥新藥（new Chinese medicine）以中醫理論為指導，以綜合臨床療效為出發點，運用天然藥物研究的基本原理和方法，開發和研究中藥新藥。開發中藥新藥，應注意了解臨床需要、市場短缺或未飽和的藥物，并根據臨床需要選擇劑型。同時，我們應該密切關注藥物狀況和政策法規。中藥由于其獨特的保健特點、毒副作用小、治療費用低廉，非常適合在OTC市場銷售。

1.正交試驗設計與均勻試驗設計

正交試驗設計(Orthogonal exPerimental design)是基于正交性，從全面試驗中選擇一些有代表性的點。這些代表點具有“均勻分散，整齊可比”的特征，“均勻分散”只要通過這部分試驗，就能反映全部全面試驗情況，所以使試驗點具有代表性?！罢R可比”可用數理統計方法對實驗結果進行處理，在只考慮一個因素的影響時，其他因素的影響可以抵消。

正交試驗法優點：

（1）試驗點具有代表性，試驗次數很少。

（2）可以在不重復測試的情況下估計實驗誤差。

（3）可以分清因素的主次。

（4）采用數理統計方法處理實驗結果，提出預測條件。

正交試驗法不足：

正交試驗適用于水平數不多的實驗。如果一項試驗中有s個因素，每個因素各有q水平，并且通過正交試驗來安排，則至少需要q2個試驗。當q較大時，q2將更大，使實驗者望而生畏。對這種類型的試驗設計，均勻設計非常有用。

均勻設計又稱均勻設計試驗法（Uniform Design ExPerimentation），均勻設計就是只考慮試驗點在試驗范圍內均勻散布的一種實驗設計方法，也是通過一套精心設計的表來進行實驗設計的。

均勻試驗法的特點

（1）每個因素的每個水平都只進行一次試驗，這大大降低了試驗次數。

（2）任兩個因素的試驗點在平面的格子點上，每行每列有且僅有一個試驗點。

（3）均勻設計表任兩列組成的實驗方案通常不相同，所以每個均勻設計表必須有一個附加的使用表

（4）隨著因素的水平數增加，試驗次數按水平數的增加量而增加。

（5）用計算機處理實驗數據，方便、準確、快速地求解定量回歸方程。分析各因素對實驗結果的影響，可對優化條件進行定量預報及對實驗結果區間估計進行優化。

試驗設計結果分析

目的：選出各因素最佳水平以形成優選的實驗方案。確定每個因素對指標影響的主要和次要關系。方法：對于正交試驗結果，進行直觀分析和方差分析。對于均勻設計結果，通常使用多元回歸分析。將統計結果與生產實踐相結合，進行綜合分析，以確定最佳的提取工藝條件。最后，還應進行驗證試驗，無驗證試驗的優選結果沒有價值。

正交設計應用舉例：

正交試驗法優選芪葛顆粒的提取工藝

（1）定因素：根據目的和文獻調研，預實驗確定為芪葛顆粒的加水量、提取時間和提取次數三個因素。

（2）劃水平：分別選取加水量（8倍、10倍、12倍）提取時間（30min、60min、90min）提取次數（1次、2次、3次）三個水平。

（3）選正交表：采用L 9(3 4)正交設計

（4）橫著做試驗：因素位于表頭，水平對號入座→試驗，并記錄試驗效應的指標數值。

（5）數據處理：選擇每個因素的最佳水平以形成優化的實驗方案。確定每個因素對指標影響的主要和次要關系。方法有直觀分析和方差分析。直觀的結果表明，影響綜合得分順序大小的因素是：C(提取次數)＞A(加水量)＞B(提取時間)方差分析表明，只有煎煮次數對綜合評分有顯著影響，加水倍數和煎煮時間均無顯著影響[17]。雖然提取時間對提取量沒有明顯影響，但黃芪甲苷和葛根素的提取量隨提取時間的延長而降低。結合上述分析結果，最終提取工藝條件為：A3 B1 C3，即加入12倍水，提取3次，每次30 min[17]。

（6）驗證試驗：取3倍處方量藥材3批，按最佳提取條件提取。結果顯示黃芪甲苷的含量為0.590 mg.ml-1(n=3),葛根素的含量為8.248 mg.ml-1,(n=3)，表明各成分提取均較完全，且重復性良好，本研究確定的最佳提取工藝切實可行、可操作性強[17]。

正交試驗法優選天麻提取工藝研究：

(1)定因素：根據目的和文獻調研，預實驗確定提取過程中乙醇濃度、溶媒用量、提取次數為三個因素。

(2）劃水平：分別選取乙醇濃度（60%70%80%）溶媒用量（6倍8倍10倍）提取次數（2次3次4次）三個水平。

（3）選正交表：采用L 9(3 4)正交設計

（4）橫著做試驗：因素位于表頭，水平對號入座→試驗，并記錄試驗效應的指標數值，采用HPlC法測定天麻中天麻素含量。

（5）數據結果：天麻素在0.1428～0.7140μg(r＝0.9994)范圍內線性關系良好，平均回收率為100.01%，RSD為1.04%[16]。結果顯示，每種提取因素均對天麻素的提取率和提取出膏率有影響，乙醇濃度對天麻素提取率和天麻提取物出膏率的影響是主要因素，且對出膏率影響較顯著，以60%乙醇提取效果最佳。綜合考慮，最終選擇6倍量60%乙醇回流提取2次，以獲得最佳的天麻提取工藝[16]。

（6）驗證試驗：稱取3份天麻藥材，每份8.0 g，精密稱定，并根據上述測定的天麻最佳提取工藝分別提取，并測定了天麻素的提取率和天麻提取物的出膏率[16]。工藝驗證結果表明，通過本試驗確定的提取工藝提取出的天麻素提取率較高、工藝穩定[16]。

均勻設計應用舉例：

均勻試驗設計優選干姜超臨界萃取物微囊制備工藝：

（1）提取指標的測定：以載藥量、包封率為指標。

（2）提取工藝的均勻試驗設計：采用均勻設計對囊芯與囊材比例（x1）、進風溫度(x2)、進液速度（x3）進行考察并進行綜合評分。使用綜合評分法，綜合評分=載藥量×100/最大載藥量×權重0.8＋包封率×100/最大包封率×權重0.2，按照U 5(5 4)表安排試驗，進行3因素5水平的均勻設計試驗[11]。

（3）數據處理：得回歸方程：Z=73.9905－7.5882χ1+0.1930χ2-1.3263χ3(P=0.024 8，r=0.999 2)，結果可信。在z值取最大時，χ1=1：1.1、χ2=159.5、χ3=7.5。綜合生產情況，選擇囊芯物和囊材比例為1：1.1，進風溫度為160℃，進液速度為8 mL.min-1[11]。

（4）驗證試驗：取處方量藥材3份，分別優選工藝制備微囊，測定各指標并進行評價。得到的總得分在預測區間內，表明優選的工藝是穩定且可行的。

黨參多糖提取工藝優化及不同購買地黨參多糖含量比較：

（1）提取指標的測定：使用葡萄糖作為標準，根據標準曲線方程計算多糖的濃度。多糖提取率=多糖濃度×待測液體積／藥材粉末質量[12]。

（2）提取工藝的均勻試驗設計：采用U6(3×63)均勻試驗設計，選擇影響多糖提取較大的4個工藝參數，分別為溫度、液料比、提取時間和超聲功率，并比較10種不同購買地黨參多糖含量[12]。

（3）數據處理：得多元回歸方程為：y=0.338X4-0.002χ2×χ4－8.369.其中，χ1為提取溫度，χ2為液料比，χ3為提取時間，χ4為功率.R2=0.963，結果顯著(F=39.484，P=0.007)，說明回歸模型有效[12]。從回歸方程可以看出，提取功率對黨參多糖提取率的影響最大，液料比與提取功率產生的交互作用次之，提取溫度與提取時間在選定范圍內對回歸方程沒有影響，為獲取最高提取率使得X4最大選擇135 W[12]。χ2×χ4最小即使得χ2為25，綜上分析結合單因素結果得到最佳優化工藝為提取溫度70℃，提取液料比為25：1，提取時間為35min，提取功率為135 W，預期多糖提取率為30.51%[12]。

（4）驗證試驗：分別以上述最佳工藝，提取多糖3次。提取率分別為31.86%，31.19%，30.74%，其平均得率為31.26%，相對誤差為0.024，接近理論值，表明上述均勻設計結果的可靠性[12]。

2.討論

試驗設計越簡單、無交叉，大生產可行性越大。所以，在制定試驗設計時，應將實際情況考慮進去。使其具有可操作性，安全性大。同時，生產成本也是我們需要考慮的一個關鍵因素，減少一個操作單元或包裝的成本，則可大大降低工業化生產成本。將各方面因素綜合考慮，通過合理的試驗設計制定更貼近實際生產的工藝路線。使中藥新藥的研究不僅僅是實驗室研究，而真正能滿足臨床需要。

3.結語

綜上，在中藥新藥的研究中，我們必然會遇到試驗設計方案的確立和用數理統計方法處理數據的問題。在設計上，我們應該根據實驗條件提前制定合理的試驗設計方案。在數據處理上，切不可拿到數據再考慮統計方法。這樣做無異于亡羊補牢，為時晚矣。合理的試驗設計方法能幫助我們在實驗時做到心中有數，節省時間，提高效率，結果可靠。在中藥新藥的研究中起到了至關重要的作用。