Xpert MTB/RIF技術對疑似淋巴結結核診斷價值

周 林 謝文君 聶姬鋒 朱 敏

作者單位：浙江省中西醫結合醫院微創外科（周林，聶姬鋒）、病理科（謝文君）、結核科（朱敏）（杭州 310004）

淋巴結結核是最常見的肺外結核，約占全部肺外結核的30%～40%。由于淋巴結核進展期常并發膿腫及竇道，患者傷口長期不愈，給患者帶來極大痛苦，所以早期快速診斷對其治療尤為重要。病理診斷和病原學診斷在淋巴結核中具有重要意義，然而由于相當一部分病例缺乏典型病理學形態及含菌量少，臨床診斷仍存在困難。Xpert MTB/RIF方法是一種快速、全自動的核酸擴增檢測。我們在既往研究中在采用該方法檢測臨床確診的淋巴結結核標本，取得滿意效果[1]。本研究探討Xpert MTB/RIF技術對疑似淋巴結結核診斷的價值，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 研究對象 選取2016年4月—2018年4月在浙江省中西醫結合醫院門診及住院的初診疑似淋巴結結核患者100例作為研究對象，其中女性74例，男性 26 例，年齡 21～63 歲，平均（31.5±9.6）歲。所有患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核通過（浙江省中西醫結合醫院倫理臨審201603號）。

1.2 納入、排除標準 納入標準：（1）體表可觸及腫大的淋巴結，抗生素治療兩周及以上無效，同時伴有肺結核和/或其他部位結核；（2）淋巴結軟化形成膿腫，CT或B超提示淋巴結中央壞死；（3）外院淋巴結穿刺病理提示肉芽腫性淋巴結炎。滿足以上任意1條即納入研究組。排除標準：經活檢或細針穿刺病理檢查，明確診斷為淋瘤，轉移性腫瘤等非淋巴結結核疾病者；不進行診斷性抗結核治療及隨訪。

2 方法

所有患者接受淋巴結細針穿刺或者淋巴結切除術，所取得的標本分別進行Xpert MTB/RIF檢查，病理學檢查（包含細胞學涂片和組織病理切片，同時進行HE染色和抗酸染色）以及BACTEC MGIT 960液體快速培養。

2.1 Xpert檢測 采用美國Cepheid公司全自動GeneXpert儀器及Xpert MTB/RIF試劑盒，取約1mL標本置于前處理管中，加入2mL前處理液。震蕩20s后靜置15min至標本完全溶解，利用移液槍將上清液轉移至反應盒中，將反應試劑盒掃描二維碼，錄入信息，放入儀器中，2h后讀取數據。

2.2 BACTEC MGIT 960液體快速培養 采用美國BD公司生產BACTEC MGIT 960全自動分析儀，按標準操作程序進行分枝桿菌快速培養，陽性培養液進行一線抗結核藥的藥敏試驗。同時陽性培養液接種至羅氏固體培養基，采用對硝基苯甲醛法鑒定結核分支桿菌（MTB）或非結核分枝桿菌（NTM）。并采用改良羅氏絕對濃度間接法進行抗結核藥物的敏感性試驗。具體操作步驟參照《結核病診斷細菌學檢驗規程》[2]進行。

2.3 病理學檢查 每份標本制作2張病理切片或涂片（膿液標本），分別進行HE染色和抗酸染色。根據《中國結核病病理學診斷專家共識》[3]，病理結果判定：（1）膿液涂片或病理切片，經抗酸染色染色可見分枝桿菌為確診淋巴結結核；（2）HE染色發現干酪樣肉芽腫或干酪樣壞死，為確診淋巴結結核；（3）HE染色顯示上皮樣肉芽腫性炎和（或）凝固性壞死，但抗酸染色陰性者判為疑似淋巴結結核；（4）不符合前3項任何1項者判為病理結果陰性。

2.4 淋巴結結核診斷標準[4]以臨床最后綜合診斷為金標準，滿足下列任意1項即可診斷為淋巴結結核：（1）病理學檢查確診；（2）結核分枝桿菌培養陽性；（3）疑似患者經診斷抗結核治療有效者，臨床診斷為淋巴結結核。

2.5 診斷性抗結核治療指征及治療結果判定 （1）診斷性抗結核治療指證：病理診斷疑似且Xpert檢測陽性者但培養陰性患者進行HRZE方案1～3個月診斷性抗結核治療。病理檢測，培養和Xpert檢測皆為陰性患者進行密切隨診，如淋巴結進行性腫大或者出現壞死者進行診斷性抗結核治療。

2.6 治療結果判定 經過診斷性抗結核治療后，臨床觀察病情有緩解，影像學檢查顯示最大淋巴結長徑縮小1/3以上者認為抗結核治療有效。

2.7 統計學方法 使用簡明統計14.0統計軟件進行數據分析，計算Xpert方法檢測結核分枝桿菌的敏感度和特異度。使用卡方檢驗比較三種檢測方法的敏感度及特異度差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 病例納入及最后診斷結果 本組100例疑似淋巴結結核患者納入研究，最后確診淋巴結結核88例，其中頸部淋巴結結核83例，腋下淋巴結結核4例，腹股溝淋巴結結核1例。確診非淋巴結結核12例，其中貓抓病性淋巴結炎4例，壞死性淋巴結炎4例，結節病2例，異物肉芽腫1例，非結核分支桿菌性淋巴結炎1例。

3.2 三種方法在88例確診淋巴結結核中的檢測結果 以最后臨床確診的88例淋巴結結核病例為標準，Xpert檢測、病理及960快速培養檢出結核分支桿菌的敏感度分別為 95.45%（84/88），69.32%（61/88）和 23.86%（21/88），特異度為 100%（12/12），100%（12/12）及 91.67%（11/12）。Xpert檢測的敏感度明顯高于病理（χ2=20.711，P＜0.01）和 960 快速培養（χ2=93.701，P＜0.01）。

3.3 三種方法在12例確診非淋巴結結核中的檢測結果 在12例非淋巴結結核病例中，病理疑似有8例，960培養陽性1例，經菌種鑒定為非結核分枝桿菌，三種檢測方法特異度無明顯差別（χ2=2.057，P＞0.05）。

3.4 Xpert MTB/RIF技術檢測淋巴結結核的利福平耐藥結果 在21份MTB培養陽性的標本中，經抗結核藥物敏感試驗確定有5例耐藥菌株，1例為利福平及異煙肼耐藥，3例為利福平耐藥，1例為利福平、異煙肼和鏈霉素耐藥。在5例耐藥樣本中，Xpert MTB/RIF全部檢測出rpoB基因突變，檢測敏感度為100%（5/5）。在培養陰性的確診淋巴結結核病例中，XpertMTB/RIF檢測出1例利福平耐藥陽性，經過復檢仍為陽性。

4 討論

淋巴結結核目前臨床主要依靠病理，分枝桿菌培養和影像學來診斷。由于淋巴結結核組織中含菌量少，臨床上培養陽性率并不高，培養陰性也不能否定淋巴結結核的診斷，而且培養周期長，即使是960液體培養最快也需要13天，常常延誤治療。病理檢查在淋巴結結核診斷中具有重要的意義，其確診依據主要有發現干酪樣壞死的肉芽腫及抗酸染色發現分枝桿菌。然而由于病期不同和病理形態的多樣性，相當一部分病例中只有肉芽腫樣改變，而無典型的干酪樣肉芽腫和壞死結構，其他非結核性疾病也可以出現類似的肉芽腫，常導致鑒別困難。而且對于液化壞死的淋巴結結核，其標本難以獲得結構較完整的組織學行病理學檢查，加上抗酸染色陽性檢出率較低，導致臨床病理常無法做出確切診斷[5]。菌陰及病理不典型的病例往往是臨床診斷的難點所在。

Xpert MTB/RIF技術又稱為半巢式實時熒光定量核酸擴增檢測技術，能同時進行結核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測，檢測時間僅需2h。既往大量研究里，該技術已顯示出在肺結核診斷的優異性能[6-7]。2013年，WHO推薦將Xpert技術用于肺外結核的診斷。Tadesse等[8]應用Xpert MTB/RIF檢測143例，疑似淋巴結結核細針穿刺活檢樣本，以培養陽性或涂片陽性為金標準做比較，檢測的敏感性為87.8%，特異性為91.1%。近年來國內也陸續有少量類似研究[9-10]。但上述研究多單純以培養或病理作為金指標比較，這樣容易遺漏菌陰性及病理不典型的淋巴結結核，低估Xpert方法的診斷效能。有的只是在確診淋巴結結核樣本中檢測，缺乏前瞻性的研究。既往研究中將Xpert MTB/RIF技術用于檢測臨床確診淋巴結結核樣本中的結核分枝桿菌，并以非結核樣本作為陰性對照，結果顯示該技術具有極為優異的敏感度和特異度[1]。在此基礎上，本研究納入疑似淋巴結結核病例進行前瞻性研究，并綜合病原學，病理以及診斷性抗結核結果，以臨床綜合診斷作為標準，對Xpert MTB/RIF方法的診斷效能進行更真實的評價。本研究顯示，Xpert MTB/RIF技術在疑似淋巴結結核病例中具有較高的診斷效能。在最后臨床確診88例淋巴結結核中，Xpert MTB/RIF技術的檢測敏感度高達95.45%，明顯優于病理檢測及960液體培養，而特異度無明顯差別，與我們前期研究結果一致。在臨床確診的淋巴結結核中，病理檢查結果為疑似的有27例，960液體培養陰性的為67例，而Xpert方法仍能在上述病例中分別檢測出24例和63例陽性，這可能與該方法只需檢測出標本中少量存在的結核分枝桿菌DNA，而無需完整的菌體或者活菌有關，也顯示出該方法在病理不典型和菌陰性病例中的特殊診斷優勢。我們發現在12例非淋巴結結核病例中，960液體培養有1例陽性，經菌種鑒定證實為非結核分枝桿菌，而Xpert方法檢測結果為陰性。由于具有相似的臨床表現及病原學形態，在培養陰性的情況下非結核分支桿菌淋巴結炎與結核性淋巴結炎極難鑒別[11]，而Xpert方法只針對結核分枝桿菌DNA進行擴增，理論上該技術應能快速有效鑒別結核及非結核分支桿菌感染，但還需更多病例研究證實。

Xpert MTB/RIF技術可通過檢測是否存在rpoB基因突變來證實有無利福平耐藥。研究顯示，在5例耐藥樣本中，Xpert MTB/RIF全部檢測出rpoB基因突變，檢測敏感度為100%（5/5）。在培養陰性的確診淋巴結結核病例中，Xpert MTB/RIF方法發現1例利福平耐藥陽性，經過復檢仍為陽性，我們推測該樣本存在利福平耐藥，但由于含菌量少，所以導致液體培養陰性。由于檢測時間短，Xpert MTB/RIF方法的利福平耐藥檢測可以有效指導早期抗結核方案，但由于二線抗結核藥物昂貴，在沒有藥敏結果的情況下，我們建議針對Xpert MTB/RIF方法檢測出的利福平耐藥應復檢，如仍為耐藥可以結合臨床抗結核治療效果改用二線藥物。

綜上所述，Xpert MTB/RIF方法具有操作簡便、耗時短、敏感度及特異度高的特點，能同時在淋巴結結核標本中行結核分枝桿菌檢測及利福平耐藥診斷，在診斷淋巴結結核中具有較高的診斷效能，并能早期指導有效抗結核治療，尤其是在病理疑似和菌陰性淋巴結結核的診斷中具有特殊優勢，值得作為診斷淋巴結結核的方法常規推廣應用。