苦參對耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 細胞上皮間質轉化及吉非替尼藥物敏感性的影響

沈云飛 詹建偉

肺癌是當今世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的75%～80%，5 年生存率低于50%，表皮生長因子受體（EGFR）突變的肺腺癌患者占有較大比例，目前靶向藥物治療被推薦作為一線治療[1]。靶向藥物的廣泛應用，導致癌細胞對靶向藥物耐藥而嚴重影響療效，也是治療失敗的主要原因[2]。如何增加肺癌細胞對靶向藥物的敏感性、揭示其耐藥機制，是目前國內外研究的熱點與難點[3]。本實驗采用體外苦參作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 細胞，分別通過MTT 法、流式細胞術、侵襲實驗檢測經苦參干預的耐藥細胞株對吉非替尼藥物敏感性和侵襲轉移能力的變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞株 人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD 細胞株由浙江大學醫學院提供。

1.2 主要試劑和材料 吉非替尼（AstraZeneca UK Limited，規格：0.25g/片，批號KK429）；復方苦參注射液（山西振東制藥股份有限公司，規格：5mL/支，批號990809）；磷酸鹽緩沖溶液（批號YM-S1065）及胰酶（批號185204）由杭州吉諾生物醫藥技術有限公司提供；胎牛血清（批號10099-141）及DMEM 培養基（批號SH30023.01B）由北京畢特博生物技術有限責任公司提供；β-Actin 抗體（批號SC-8007）、山羊抗兔IgG 二抗（批號SC-5123）、甲基偶氮唑藍（MTT）（批號185041）由杭州聯科生物技術股份有限公司提供。

1.3 方 法

1.3.1 常規細胞培養 將處于對數生長期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD 細胞株接種至5cm×5cm 大小的培養瓶，在37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞鋪滿培養瓶80%進行傳代并進行下一步實驗，傳代時將部分細胞凍存至液氮罐中，解凍后細胞狀態正常。

1.3.2 MTT 法檢測細胞抑制率 將對數期生長的耐吉非替尼PC9/ZD 細胞株消化離心后鋪板在96 孔板內，細胞濃度為（3～5）×104/mL，每孔100μL 細胞懸液，將細胞分為對照組（不含藥物培養液）、吉非替尼組（吉非替尼0.5、2、8、32μg/mL），每個濃度梯度設置3 個復孔，邊緣孔用無菌PBS 填充。培養24h 后進行MTT 試驗，酶標儀波長為490nm，測OD 值，觀察細胞的生存狀態從而得出IC50。根據MTT 結果篩選出最接近IC50 的吉非替尼濃度8μg/mL 與苦參進行聯合，將細胞分為對照組（不含藥物培養液）、吉非替尼組（8μg/mL）和苦參聯合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）進行MTT 試驗。苦參濃度選擇依據：當苦參濃度為0.5mg/mL 時24h 細胞生長抑制率小于10%，因此可視為無細胞毒性的苦參濃度。

1.3.3 Western blot 檢測相關蛋白表達 將耐吉非替尼PC9/ZD 細胞懸液傳代至5cm×5cm 大小的培養瓶，對照組（不加藥物），吉非替尼組（8μg/mL），苦參聯合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）培養24h，細胞長到對數生長期，采取RIPA 裂解法提取蛋白，選用BSA 母液測量蛋白濃度，后計算上樣量跑電泳，PVDF 膜進行轉膜，室溫脫脂奶粉進行封閉，一抗孵育2h，PBST 洗脫3 次，二抗孵育2h，PBST 洗脫3 次，ECL 化學發光顯色。

1.3.4 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 將對數期生長的耐吉非替尼PC9/ZD 細胞株消化離心后，細胞濃度為5×104/mL，對照組（不加藥物），吉非替尼組（8μg/mL），苦參聯合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）。將60μL 的DEME 培養基稀釋6倍的Matrgel 膠加入transwell 小室中，后在transwell上下室中分別加入200μL 細胞懸液和含500μL 10%FBS 培養基，設置3 個復孔，培養24h 棄液，并用濾紙吸干，4%多聚甲醛常溫固定15min，0.1%結晶紫染色液染色20min，烤箱烤干后計數觀察，每個小室隨機抽取5 個視野。

1.3.5 流式細胞術測量細胞凋亡 對照組（不加藥物），吉非替尼組（8μg/mL），苦參聯合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）培養24h 后，將單細胞懸液加入離心管中，1500rpm，離心5min 棄上清，加入PBS 洗滌離心棄上清，加入預冷PFA，4°C固定30min，離心棄上清，PBS 洗滌離心棄上清，加PI室溫避光孵育30min，混勻，上機檢測。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件進行分析與處理數據，計量資料采用均數±標準差表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗；計數資料采用百分比（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05 提示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 苦參對吉非替尼誘導的人肺腺癌PC9/ZD 細胞增殖抑制的影響 吉非替尼組人肺腺癌PC9/ZD 細胞增殖抑制率（33.46±0.84）%，苦參聯合吉非替尼組細胞增殖抑制率（74.59±3.21）%，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 苦參對吉非替尼誘導的人肺腺癌PC9/ZD 細胞EMT 相關蛋白表達的影響 在苦參作用下，吉非替尼誘導的人肺腺癌PC9/ZD 細胞波形蛋白及N 鈣黏蛋白表達下調，E 鈣黏附分子表達上調，見插頁圖1。

2.3 苦參可增強吉非替尼對人肺腺癌PC9/ZD 細胞的侵襲抑制能力 對照組、吉非替尼組及苦參聯合吉非替尼組人肺腺癌PC9/ZD 細胞侵襲率分別為（91.03±11.02）%、（64.23±8.04）%、（48.59±7.26）%，組間兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.05），見插頁圖2。

2.4 苦參可增強吉非替尼誘導的人肺腺癌PC9/ZD細胞凋亡 對照組人肺腺癌PC9/ZD 細胞凋亡率（31.14±5.26）%；吉非替尼組細胞凋亡率（56.48±8.77）%，當吉非替尼濃度不變時，聯合使用苦參組細胞凋亡率（76.25±10.28）%，組間兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.05），見插頁圖3。

3 討 論

腫瘤細胞發生耐藥的原因相當復雜，包括耐藥基因異常表達，DNA 損傷修復及抑制細胞凋亡等途徑。苦參的主要活性成分為苦參堿，有報道顯示，其可通過抑制細胞增殖，誘導凋亡克服腫瘤的多藥耐藥現象[4-6]。但是目前，苦參對吉非替尼誘導的人肺腺癌PC9/ZD 細胞株耐藥情況尚不明確。本研究結果顯示，當苦參濃度為0.5mg/mL 時，可顯著增強吉非替尼誘導的PC9/ZD 細胞增殖抑制和凋亡敏感性。提示苦參可調控肺癌細胞的吉非替尼藥物敏感性。但是其作用機制仍需進一步研究。

腫瘤細胞的多種生物學過程改變均會導致細胞內上皮間質轉換（EMT）的異常改變，進而改變細胞的生物學行為[7]。EMT 以上皮標志物蛋白（E-鈣黏蛋白、EpCAM 等）的下調及間葉標志物蛋白（如波形蛋白、纖連蛋白等）的上調為主要特征，與腫瘤多藥耐藥密切相關[8-11]。EMT 現象最早在晶狀體細胞中發現[12]，其在肺癌的侵襲轉移和細胞細胞耐藥過程中扮演著重要角色[13-15]。Shintani 等[16]研究發現，在非小細胞肺癌組織中，EMT 是造成肺癌細胞對紫杉醇和順鉑產生耐藥的主要原因；Su 等[17]對吉非替尼耐藥的細胞研究發現，細胞表現出顯著的E-cad 表達下調的EMT 特征；通過對比非小細胞肺癌發生EMT的程度與癌細胞對酪氨酸激酶抑制劑類（TKIs）藥物的敏感性相關度發現，EMT 程度低得癌細胞對TKIs類藥物的敏感性顯著高于EMT 程度高的癌細胞[18]。提示EMT 可能是TKI 類藥物產生耐藥的重要因素之一。本研究結果顯示，苦參作用可以顯著增強吉非替尼誘導的PC9/ZD 細胞波形蛋白、N 鈣黏附蛋白表達下調，E 鈣黏蛋白表達上調，增強吉非替尼對細胞侵襲能力的抑制。提示在耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 細胞中，苦參對吉非替尼藥物敏感性的影響可能是通過調控EMT 過程實現的。

綜上所述，苦參能改善耐吉非替尼細胞對吉非替尼的敏感性，可能通過逆轉EMT 過程改善腫瘤細胞生物學過程，但是苦參逆轉上皮間質化過程的具體機制仍需進一步研究。