間充質干細胞治療心肌梗死的研究進展*

宋曉玥，程灝，陳璐 綜述；馬劍英 審校

（復旦大學附屬中山醫院 心內科,上海 200032）

隨著社會經濟的高速發展，高度城市化和社會老齡化帶來的問題日漸突出，居民不健康的生活習慣普遍流行，心血管危險因素普遍暴露。根據《中國心血管病報告2017》概要推算我國心血管病現患人數2.9億，其中腦卒中1 300萬，冠心病1 100萬，肺源性心臟病500萬，心力衰竭450 萬，風濕性心臟病250萬，先天性心臟病200 萬，高血壓2.7億[1]。我們必須認識到我國乃至全球心血管病發病人數將長期保持高速增長的態勢，心血管疾病已成為世界范圍內成人死亡和致殘的主要原因之一，防治心血管疾病刻不容緩。

心肌梗死是心血管疾病的一種嚴重表現，是臨床上一種嚴重的缺血性心肌病。梗死的心肌組織逐漸被缺乏彈性的瘢痕組織所替代，為了滿足心臟收縮舒張的功能，發生代償性心腔增大、心肌肥厚，心室發生適應不良性改變導致心室重塑，引起心室泵血功能低下，最終發展成為心力衰竭。梗死后心衰將導致心肌細胞不可逆的丟失，雖然目前的藥物治療、冠脈介入手段、冠脈搭橋手術等臨床治療手段在一定程度上延緩了病情，但并不能逆轉疾病的發展。干細胞移植療法為心肌損傷修復提供了有治療前景的選擇方向，尤其是屬于成體干細胞的間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs），具有強大的多向分化潛能和增殖能力，被視為理想的組織修復種子細胞。MAKINO等[2]研究從大鼠間充質干細胞中分離出心肌原性細胞系，在體外用5-氮胞苷誘導處理后30%細胞發生形態改變，表現出成纖維細胞樣形態，具有心肌樣細胞特點，由此打開了間充質干細胞的心血管研究領域的大門。

1 間充質干細胞定義

干細胞包括胚胎干細胞與成體干細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能。間充質干細胞是一類起源于發育早期的中胚層[3]和小部分外胚層的成體干細胞，廣泛來源于骨髓、外周血、臍帶、胎盤、脂肪及牙髓[4]等組織。早在1976年，FRIEDENSTEIN等[5]首先報道骨髓中一種貼壁、長梭形成纖維樣細胞，呈克隆性生長，定義為“成纖維細胞樣集落形成單位”。1991年，CAPLAN[6]發現此種細胞有自我更新和分化能力，正式定義為骨髓間充質干細胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）。因為缺乏表面特異標志物，間充質干細胞目前尚無統一的定義標準。對人類間充質干細胞，國際細胞治療協會提出了以下幾點定義標準[7]：①標準培養條件下貼壁；②白細胞分化抗原105（cluster of differentiation 105, CD105），CD73和CD90，不表達CD45，CD34，CD19或CD11a和人類白細胞抗原-DR等造血細胞標記物；③體外可分化為成骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞。

2 間充質干細胞特性

2.1 高度自我增殖能力與多向分化潛能

間充質干細胞具有強大的自我更新能力，貼壁后快速生長，經多次傳代擴增后仍具有干細胞特性。在體外或體內適當誘導條件下，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱、韌帶、內皮、神經、肝和心肌等多種組織細胞，被視為理想的組織修復種子細胞。

2.2 低免疫原性與免疫抑制反應

間充質干細胞低表達包括CD80、CD86、人類白細胞抗原II（human leukocyte antigen-II,HLA- II）和CD34等在內的共刺激因子，這使得間充質干細胞不但不能誘導免疫應答，而且還有抑制免疫反應的作用[7]，通過與細胞直接接觸或者分泌細胞因子抑制T細胞與B細胞的免疫活動[8]。在自然殺傷（natural killer, NK）細胞活化前接觸間充質干細胞，NK細胞介導的細胞毒性、細胞因子生成、細胞膜上活化受體的表達和顆粒酶B的釋放會被干擾。在間充質干細胞的暴露下，未成熟樹突狀細胞無法正常分化為成熟的樹突狀細胞，從而不能有效地活化初始T細胞和刺激T細胞增殖。此外，ABUMAREE等[9]認為間充質干細胞與炎性細胞接觸后可分泌白細胞介素-10（interleukin 10, IL- 10）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、 血 管 內 皮 生 長 因 子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等細胞活性分子，從而促進單核細胞向抗炎性巨噬細胞（M2）的分化，同時抑制其分化為促炎性巨噬細胞（M1），以進一步發揮間充質干細胞的免疫抑制作用。

2.3 損傷趨化歸巢作用

干細胞歸巢是指干細胞移植后在特定條件下定向性移動至靶組織、靶器官的表現。SAITO等[10]首次提出間充質干細胞具有歸巢能力。當機體遭遇損傷時，損傷部位會釋放特殊的內分泌信號，分泌多種細胞因子、趨化因子、黏附因子，引導干細胞的靶向歸巢，發揮組織修復功效。BARBASH等[11]研究發現心肌梗死大鼠靜脈輸注帶有標記的間充質干細胞后，1周內可在梗死區域發現標記細胞，而對照組僅可在骨髓中發現標記細胞。研究[12]發現基質細胞衍生因子-1/CXC趨化因子受體-4（stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor type 4, SDF-1/CXCR4）信號通路通過激活Src家族，介導間充質干細胞的趨化作用，招募更多祖細胞到梗死區域修復心臟。

3 間充質干細胞移植的作用機制

3.1 電-機械偶聯

由間充質干細胞分化而來的心肌細胞與宿主心肌細胞間以閏盤結構相連，組成功能統一體，形成協調一致的電-機械偶聯，改善心功能。KHAN等[13]研究發現camp-Epac-Rap1信號通路的激活可以使間充質干細胞高效地結合在梗死心肌上并且分化成心肌樣細胞，從而增強心肌功能。

3.2 分化為心肌細胞

一系列研究證實間充質干細胞可在一定條件誘導下分化成心肌細胞，增加梗死區心肌數量，促進心臟功能的恢復。早在1999年，TOMITA等[14]發現經5-氮胞苷處理的間充質干細胞在體外培養，第10天相互連接肌管形成，第21天心肌特異性肌鈣蛋白I和肌凝蛋白重鏈染色陽性，將誘導后的間充質干細胞移植到大鼠心肌凍傷形成的瘢痕組織,結果瘢痕面積縮小,心功能有所改善。KANG等[15]研究結果表明5-氮胞苷和I型膠原的納米分子在間充質干細胞移植到梗死區域后，通過形成肌管樣結構與相鄰細胞連接，增強轉錄因子GATA-4和Nkx2.5、肌鈣蛋白I，β-肌球蛋白重鏈和心臟的α-肌動蛋白基因的表達。

3.3 旁分泌效應

雖然在體內間充質干細胞可以分化為心肌細胞，但是由于梗死區域復雜的微環境，移植細胞存活難度大，與明顯改善的心功能不相匹配，推測間充質干細胞移植到心肌組織后發揮的旁分泌作用是改善心功能的主要機制。BOBI等[16]研究發現心梗動物模型建立成功后，經冠脈注入同種異體脂肪來源間充質干細胞，短期可見凋亡水平降低，VEGF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）和SDF-1等表達上調，M2巨噬細胞增加；長期來看心肌血流灌注增加，血管密度增加。目前越來越多的研究發現間充質干細胞通過外泌體途徑發揮旁分泌作用，進行細胞間交流。ZHANG等[17]發現將間充質干細胞來源外泌體與心臟干細胞共培養，可以增加內皮細胞分化，加強血管新生，減少纖維化，起到修復心肌的功效，提示外泌體是間充質干細胞的關鍵活性成分。MAO等[18]通過轉染的方式使MSCs高表達整合素連接激酶,并將其注射到大鼠梗死心肌上，結果發現其可抑制心肌細胞增殖,降低I型和III型膠原的基因表達，有助于減少纖維化,縮小心梗瘢痕。

3.4 促進血管新生

間充質干細胞不僅可以分化為血管內皮細胞參與血管形成，還可以直接整合到血管上。整合的細胞大部分可以分泌生長因子，促進內皮細胞的成熟進而促進新生血管。JIANG等[19]移植間充質干細胞到大鼠冠脈結扎模型中，4周后通過免疫熒光分析發現，植入細胞部分表達平滑肌表型［α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）］，其他的則表現了內皮表型（CD31）。CHEN等[20]發現將具有分泌肽成纖維細胞生長因子4-堿性成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor 4-basic fibroblast growth factor, FGF4-bFGF）基因轉染骨髓間充質干細胞聯合治療，通過促進新生血管生成、抗心肌細胞凋亡、抑制左室重塑多條途徑發揮作用而改善大鼠心肌梗死后心功能。

3.5 免疫調節

間充質干細胞有著獨一無二的低免疫原性與無主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）限制性，它只表達主要組織相容性復合體MHC-I類分子，而不表達MHC-II類分子和CD80、CD86及CD40等共刺激分子。KRAMPERA等[21]研究發現，間充質的細胞免疫抑制作用，能夠抑制梗死的細胞發生炎癥反應，從而減少炎癥細胞和炎癥因子對心肌造成的急性損傷。LUGER等[22]發現在急性心梗或者缺血性心肌病中缺血再灌注過程中，靜脈輸注間充質干細胞可以緩解左室功能的進行性減弱和逆轉心室重塑。這一作用與間充質干細胞介導的抗炎免疫反應有關，抑制NK細胞和中性粒細胞活動。

4 間充質干細胞移植途徑

移植途徑主要有冠狀動脈、靜脈、心外膜、心內膜，各種途徑都存在優點與缺點，需結合實際情況進行個體化選擇。心外膜注射定位準確，但由于創傷較大，主要適用于同時進行冠狀動脈旁路移植術的患者。心內膜注射對技術水平和設備要求高，臨床上廣泛開展具有一定困難。經靜脈途徑最為簡單易行，但ASSIS等[23]觀察發現以99Tcm六甲基丙二胺肟（99Tcm-hexamethyl propylene amine oxime, 99Tcm-HMPAO）和4, 6-二氨基-2-苯基吲哚（4, 6-diamino-2-phenyl indole,DAPI）標記的間充質干細胞在經靜脈途徑移植后，注射后的干細胞約70%分布在肺部,其余分布在心臟、腎臟、脾臟和膀胱，60 min后逐漸減少。由于存在其他臟器的首過效應，只有一小部分間充質干細胞可以成功到達心肌梗死區域，而且過量注射間充質干細胞可以導致靜脈栓塞的發生。經導管可以直接注射更多的間充質干細胞到冠脈區域，定位準確，避免心肌注射損傷。但經冠脈注射途徑也會遇到問題，比如間充質干細胞體積較大，因操作不當會引起微循環堵塞而加重心肌梗死的癥狀。基于上述問題，移植途徑迎來了革新。LI等[24]發現將超聲與微泡技術結合通過上調SDF-1/CXCR4而起到促進間充質干細胞歸巢的作用。LUO等[25]將間充質干細胞的分泌因子置于聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid）, PLGA］微球內，外覆間充質干細胞細胞膜，合成在冷凍或凍干狀態下仍然保持穩定的合成間充質干細胞。移植入急性心肌梗死小鼠模型，觀察到有明顯的促進血管生成和減輕左心室重塑功效。

5 實驗研究

缺氧、缺血、缺血再灌注損傷、炎癥反應、局部結構改變等微環境不利于移植干細胞生存，為提高間充質干細胞移植效率，增強對缺血缺氧環境的耐受，減少細胞凋亡，助力干細胞治療發展，進行了一系列對間充質干細胞預處理調節基因表達，通過轉染實現基因修飾或者聯合藥物治療等的研究，為間充質干細胞治療提供了新思路。KHAN等[26]發現2, 4-二硝基苯酚（2, 4-dinitrophenol,DNP）對間充質干細胞預處理，可以抑制電子傳遞鏈活動，創造缺氧環境，上調與細胞粘附相關的kindlin-3、CD29、CD44和CD90水平，增加間充質細胞存活，粘附和歸巢MSCs，改善心臟功能和血運重建。HE等[27]研究發現過表達蛋白激酶Cε（protein kinase Cε, PKCε）的間充質干細胞通過SDF-1/CXCR4軸和PI3K/AKT通路，上調VEGF、bFGF、TGF-β、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）、血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）、SMA等水平，提高間充質干細胞的存活和分化增殖能力，改善心功能。SONG等[28]證實阿伐他汀聯合間充質干細胞治療，通過激活腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK）通路促進一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）尤其是內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表達及活化，提升新生心肌細胞增殖、抗炎、抗凋亡及抗纖維化的能力。YAN等[29]發現C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白-9（C1q/tumor necrosis factor-related protein-9, CTRP9）水平低下是導致移植的脂肪來源間充質干細胞存活不足和心肌修復作用不足的重要原因，體外實驗發現通過細胞外調節蛋白激酶1/2-金屬基質蛋白酶-9（extracellular regulated protein kinase 1/2-matrix metalloprotein, ERK1/2-MMP-9）和細胞外調節蛋白激酶1/2-紅細胞衍生核因子2樣蛋白2（extracellular regulated protein kinase 1/2-nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,ERK1/2-NFE2L2）信號通路增強間充質干細胞增殖分化和抗凋亡的能力。

6 臨床觀察

CHEN等[30]于2004年報道了首個將間充質干細胞應用于臨床的隨機對照研究，將69名在12 h內發病的急性ST段抬高型心肌梗死患者隨機分成兩組，分別予以冠脈注射自體骨髓間充質干細胞和生理鹽水，隨訪6個月顯示干細胞治療后室壁運動及左室射血分數有所提高。目前已有眾多臨床試驗和隨訪結果支持間充質干細胞移植治療可以使心肌梗死患者獲益。2011年LEISTNER[31]報告了迄今最大規模的急性心肌梗死后干細胞治療隨機試驗結果，入選的204例急性心肌梗死患者中101例患者初始隨機接受間充質干細胞治療，剩下的103例患者注入安慰劑。隨訪5年結果顯示接受干細胞治療后射血分數有輕微但穩定的改善，聯合臨床終點顯著改善。CHULLIKANA等[32]在招募的ST段抬高的急性心梗患者中，針對間充質干細胞的安全性和有效性進行了一項隨機、雙盲、I/II期研究 。結果顯示急性心梗患者在血管重建術后2 d經靜脈內輸注同種異體間充質干細胞耐受性良好，2年長期隨訪顯示不良事件發生率低于對照組。2018年LALU等[33]對間充質干細胞治療缺血性心臟病的安全性和有效性進行了薈萃分析，尤其是針對急性心肌梗死和缺血性心力衰竭。通過23項臨床研究的1 148例患者的數據分析顯示，間充質干細胞治療急性心梗和缺血性心力衰竭的整體結果是安全積極而有效的。

7 總結與展望

間充質干細胞具有來源廣泛、高度自我增殖能力與多向分化潛能、低免疫原性等優點，在心肌梗死治療中取得了一定進展，但在基礎研究向臨床應用推廣的轉化醫學過程中，還需面對移植存活率低等技術障礙。隨著實驗技術、研究發現與相關倫理知識的不斷完善，相信間充質干細胞作為組織修復的理想種子，可以為挽救心肌梗死患者不可逆細胞損傷帶來希望。