生物標志物在子宮頸癌篩查中的應用進展

徐書航 化定超 王新宇

隨著子宮頸癌篩查的普及和癌前病變的處理進一步規范，子宮頸癌的發生率和死亡率大大降低，美國癌癥統計報告顯示，2017年全美地區子宮頸癌新發病例13 240例，死亡人數4 170例[1]。目前子宮頸癌篩查主要依靠宮頸脫落細胞學檢查和高危人乳頭瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）檢測，然而宮頸脫落細胞學檢查靈敏度較低，僅60%左右，HR-HPV檢測雖有較好的靈敏度，但特異度較低。兩種篩查方式的不足易導致漏診或部分患者的過度治療。即使在發達國家，依靠目前的篩查手段仍不能達到完全消滅子宮頸癌的目的，仍需探索更有效的技術來優化篩查。

研究發現，HR-HPV感染宿主細胞后，誘導細胞發生一系列分子表達和功能的改變，繼而發生形態學改變。因此，人們設想通過對這些分子變化的檢測來幫助篩查子宮頸癌，從而更有效地提高癌前病變的檢出率，避免不必要的陰道鏡轉診。隨著研究的深入，已發現有一些生物標志物與子宮頸癌的發生、發展密切相關，為進一步的臨床應用打下了基礎。本文就目前的相關研究進展作一綜述。

1 P16INK4A蛋白

P16蛋白屬于細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI），由染色體9p21上CDKN2A基因編碼。P16通過競爭性結合細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，CDK4）對細胞周期起負向調節作用[2]。在子宮頸癌病變過程中，HPV感染宿主細胞后整合至宿主細胞DNA導致病毒癌基因E6和E7的持續高表達，繼而使P16蛋白呈現過度表達的狀態。大量研究證明，P16的陽性率隨子宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）級別的增高而增高，且與CIN進展的危險性相關[3]，提示P16蛋白作為生物標記物分流CIN的可能性。

美國病理學會（CAP）和美國陰道鏡與宮頸病理學會（ASCCP）在2012年共同發布的下生殖道鱗狀上皮病變術語（LAST）中，建議將P16免疫組化染色用于CIN2的分層管理，P16陽性的處理同CIN3，陰性的可以隨訪，且當P16陽性有連續大塊狀深棕色染色時，提示高級別鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）可能性大[4]。Clinton 等[5]通過回顧性研究發現應用LAST指南后，P16的使用率從2.8%提高到6.2%，HSIL陽性預測值從48%提高到76%。目前普遍認為P16聯合HE染色能提高病理醫師診斷CIN2+的一致性[2]。然而，Pacchiarotti等[6]研究認為P16對組織學診斷的重復性幾乎不產生影響。

此外，HPV陽性且P16陽性女性需要立即轉診陰道鏡，若陰道鏡檢查為陰性，應每年隨訪；而HPV陽性但P16陰性女性可以不用行陰道鏡檢查，2～3年隨訪一次。針對HPV陰性但組織學診斷為CIN2～3的女性，若同時P16陰性，HSIL的診斷應更為慎重[7]。Pabuccu等[8]通過研究認為P16或許能夠作為分流非典型鱗狀上皮-不除外高度病變（atypical squamous cell cannot ex－clude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASCH）的一個有效手段。

然而在P16的實際臨床應用中，還存在著一些問題。盡管大多數P16染色結果是明確的陽性或者陰性，仍有一部分結果是模棱兩可的，即僅滿足部分陽性的條件。這些模棱兩可的P16免疫反應結果是否能作為感染致癌性HPV或判斷病灶進展危險性的依據仍有待研究。Liu等[9]研究認為在預測致癌性HPV感染和HSIL的發生上，模棱兩可的P16結果弱于陽性結果，但比陰性結果強。Clark等[10]通過對262例女性的宮頸活檢結果進行研究，發現其中有50例過度診斷為HSIL，原因可能是當P16染色圖案為非塊狀時，將這樣的病例歸為HSIL，或將P16免疫組化法應用于病理診斷為LSIL的女性，提示除了對結果判讀模糊不定外，可能還存在著P16過度使用的問題。為了更準確有效地應用P16，需要對P16結果進行標準化，即能對染色結果模糊不定的情況做出準確的判斷，并且需要對LAST指南進行相應的補充，避免因為判斷失誤導致錯診或漏診。

2 P16/ki-67

抗原Ki-67是一種核蛋白，它在除了G0以外的細胞周期中均有表達。在正常生理情況下，ki-67在子宮頸鱗狀上皮細胞基層的表達是有限的，ki-67的過表達意味著細胞處于增殖期。P16/ki67在正常子宮頸鱗狀上皮細胞中互相拮抗，兩者共表達意味著細胞周期發生異常[11]。P16/Ki-67雙染細胞學檢測CIN2+和巴氏涂片檢查相比有更高的靈敏度，與HPV檢查相比有更高的特異度[12]，提示其作為CIN2+篩查手段的可能性。

研究發現，在宮頸細胞學異常人群中，P16/ki-67雙染細胞學檢查與HPV DNA檢測相比有更好的分流能力[13]，且費用效能比更高[14]。而雙染細胞學與巴氏細胞學相比分流HPV陽性女性的特異度稍低，但靈敏度更高[15]。

雖然P16/ki-67雙染檢查能顯著提高診斷準確性，然而在低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）和意義不明確的非典型鱗狀上皮（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）人群中進行危險分層的結果卻不盡如人意，尤其是在長期的臨床觀察過程中[13]。Ziemke等[16]推測可能與生物學因素有關，如年齡、閾值、重復性等，于是對1 141例女性在宮頸細胞學檢查時同時行P16/ki-67免疫組化染色（IHC），通過平均19個月的隨訪發現，＜30歲的女性檢測出CIN2/HSIL的特異度小于＞30歲的女性；以10個P16/ki-67標記細胞作為陽性標準比1個有更高的特異度；有28.4%的結果與第一次試驗結果不相符。提示P16/ki-67要進行有效應用還需要在具體檢測方法上加以規范。

3 DNA甲基化標記物

DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基加到胞嘧啶的5號碳原子上。大多數的甲基化發生在CpG島二核苷酸，常位于啟動子區域。抑癌基因（tumor suppressor genes，TSG）啟動子區甲基化導致抑癌基因失活是子宮頸癌發生、發展過程中的一個重要機制[17]。

目前已有大量待測基因甲基化研究，但是準確度不夠理想。聯合多種甲基化生物標志物，從而達到較高的靈敏度和特異度是目前的研究趨勢。此外，甲基化標志物檢測能夠提供客觀、非形態學的結果，能夠采用自我采樣樣本進行檢測，聯合現有篩查方法能夠大大提高篩查效率，未來仍需要大樣本前瞻性臨床試驗來對研究結果進行進一步驗證。

3.1 配對盒基因 1（PAX1） Kan等[18]研究結果顯示PAX1基因甲基化水平檢測CIN3+病灶的靈敏度和特異度分別達到了86%和85%，聯合巴氏涂片檢查靈敏度和特異度為89%和83%，不必要的陰道鏡轉診能減少至少60%。Li等[19]和Wang[20]分別比較了HC2 HPV檢測和MS-HRM法檢測PAX1基因甲基化在ASCUS和ASC-H中分流出CIN2+的能力，結果顯示后者檢測能力更強。此外，Nikolaidis等[21]對7項研究行Meta分析顯示，PAX1基因的甲基化檢測更高級別宮頸病變的特異度比HPV DNA檢測更高。

3.2 細胞黏附分子1（CADM1）和T淋巴細胞成熟相關蛋白（MAL） Verhoef等[22]對364例HPV陽性女性宮頸刮片進行了RCT研究，結果顯示雙標志物CADM1/MAL甲基化分流CIN2+的能力與細胞學檢查相似，甲基化水平隨著病灶嚴重程度的增加而增加，且兩者聯合能提高靈敏度，雖然特異度降低，但53.6%的陰道鏡檢查率仍在接受范圍內。已有研究認為宮頸刮片中CADM1/MAL基因甲基化水平還和高危HPV的持續感染相關，高危HPV感染持續＞5年的高級別CIN與感染持續＜5年的相比，明顯有更高的CADM1/MAL基因甲基化水平。提示雙標志物檢測能夠分流出長期存在的更晚期的高級別CIN病灶。van Baars等[23]進一步研究了在多種HPV持續感染或多種級別病灶同時存在的宮頸中CADM1/MAL基因甲基化水平，發現其是病灶特異性的，且宮頸刮片中甲基化水平往往代表著最差病灶的水平。

3.3 雙標志物MAL/miR-124-2 雙標記物MAL/miR-124-2的檢測能夠通過自采樣樣本進行，但其靈敏度同細胞學檢測相似，僅僅依靠前者進行分流也會導致不必要的陰道鏡檢查，故Verhoef等[24]希望通過研究提高MAL/miR-124-2甲基化分析的特異度。通過對1 019例自采樣為高危HPV陽性女性的RCT臨床試驗結果顯示，MAL/miR-124-2甲基化分析（閾值-80）或聯合HPV16/18基因型檢測能達到比較高的CIN3+檢出靈敏度和特異度。

4 HPV L1蛋白

HPV屬于乳頭瘤病毒科,由DNA核心和蛋白衣殼組成，而衣殼由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成。研究表明，HPV-L1陰性提示癌前病變可能性大，HPV-L1陽性提示一過性感染可能性大，且HPV L1隨著CIN級別增高而減少，在子宮頸癌中呈陰性[25]。Lee等[26]進一步研究發現HPVL1陽性但組織學CIN3+的病例可能是多種HPV感染導致的。此外，Mehlhorn等[27]研究發現HPV特異性免疫能力與LSIL的臨床緩解有顯著關聯，L1抗原和HPV16-L1抗體同時陽性的女性，發展為CIN3的危險性很低（5.8%）。利用HPV L1蛋白與CIN的關系，后續需要進一步研究其在子宮頸癌篩查中的效用。

5 microRNAs

近年來已有研究表明miRNA在子宮頸癌及癌前病變組織中呈現或上調或下調的現象，提示其作為子宮頸癌早期篩查標志物的可能性[28]。其中，miR-29a和miR-21分別是上調及下調最頻繁的[29]。

Kong等[30]研究發現hsa-mir-92a血漿水平隨著宮頸病變程度增高而顯著升高，對子宮頸癌及癌前病變診斷的靈敏度和特異度達到69.6%和80.4%，AUC為0.83。另有學者對 4 種 miRNAs（miR-9，miR-10a，miR-20a和miR-196a）進行研究得到類似的結論，且血漿miR-196a水平與CIN級別和子宮頸癌的大小，淋巴轉移，FIGO分期和分級有關，水平較高的患者總體生存率較低，提示miR-196a可能是一個早期檢測和預后判斷的生物標記物[31-32]。

在HPV陽性女性宮頸脫落細胞中，Tian等[33]發現與宮頸細胞學檢查相比，單獨的miR-424、miR-375，以及miR-424/miR-375/miR-218多標記物聯合篩查高級別CIN的方式更佳。此外，Zhu等[34]研究發現，隨著宮頸病變程度上升，MiR-21-5p上升、miR-34a下降，區分LSIL和HSIL的能力與HPV檢測相比更具有特異性。Coimbra等[35]認為ΔNp63 mRNA和miR-203是有效的子宮頸癌篩查標志物，且兩者間可能存在某種間接通路。

綜上，miRNAs能夠在血漿水平、子宮頸脫落細胞中進行檢測，對miRNAs作用機制的研究有助于對子宮頸癌病變的理解，提高對HPV陽性女性的分流效能。

6 細胞角蛋白（cytokeratin，CK）

細胞角蛋白屬于細胞質骨架蛋白中間絲的一種，上皮組織惡變后表達的細胞角蛋白與正常組織基本相同，因此細胞角蛋白被廣泛用于腫瘤的診斷。子宮頸鱗癌表達 CK5、CK6、CK7、CK8、CK13、CK15、CK17、CK18、CK19。

在子宮頸癌中，CIN2-3從鱗柱交界部（squamocolumnar junction，SCJ）細胞中形成，而 CK7 IHC 能夠分辨出SCJ[36]。Mills等[36]在四價HPV疫苗臨床試驗安慰劑組的CIN1女性中進行CK7 IHC，結果分為陰性，斑駁的，有層次的，或全厚的圖案。結果顯示全厚的CK7染色與CIN2+的進展有最高的相關性。Paquette等[37]則將CK7 IHC結果分為陽性（彌漫性的）和陰性，結果顯示陽性CK7的LSIL更易發展為HSIL。然而由于危險性增加幅度低，差異性小和陰道鏡取材的限制，CK7的臨床應用仍有待商榷。

Escobar-Hoyos等[38]研究證實從正常宮頸組織，LSIL，HSIL至宮頸癌細胞中，角蛋白17的表達上升，而角蛋白4的表達下降。角蛋白17的表達可以從LSIL患者與健康個體中分流出HSIL與鱗狀細胞癌患者，具有較高的靈敏度和特異度（分別為94%和86%），認為其是一個有效的子宮頸癌前病變篩查的生物標志物。

7 小結

篩查子宮頸癌前病變對于早期治療和預防子宮頸癌具有重要價值，尋找到一種或數種適宜的生物標志物，優化現有的篩查方法從而提高診斷的特異度和靈敏度，是目前的研究方向。盡管上述提到的生物標志物在子宮頸癌病變不同階段有特異性的表達，能夠分辨出高級別宮頸上皮內病變，但要達到臨床應用的要求，仍需要前瞻性的臨床試驗來進一步驗證和完善。