舒尼替尼治療膝骨性關節炎大鼠的實驗研究

吳柯 王金杰 莊汝杰

膝骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床上常見的退行性疾病，最常見于中老年人群。調查顯示，我國40歲以上人群KOA患病率達28.7%[1]。目前關于KOA的病因及發病機制尚未完全闡明，可能由于機械力分布失衡或負荷過度引起軟骨磨損，或其他理化因素使軟骨細胞代謝異常[2-4]。相關研究表明，血管內皮生長因子（VEGF）在KOA的發生、發展過程中發揮著重要作用，且證實VEGF會影響軟骨細胞增殖、凋亡和代謝，刺激釋放基質金屬蛋白酶（MMP）及其他代謝介質來降解軟骨基質[5-6]。本研究建立KOA大鼠模型，并使用VEGF靶點抑制劑舒尼替尼進行干預治療，觀察其關節液炎癥因子表達水平變化，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 4～5月齡的健康SD雄性大鼠32只，體重（190±10）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。隨機分為4組，即空白組、4周治療組、8周治療組、對照組，每組8只。4組大鼠在相同條件下籠養，自由攝食、飲水，室溫控制在18～22℃。KOA建模方法：在常規無菌下，從冰箱取出木瓜蛋白酶靜置30min，將4g木瓜蛋白酶溶解于100ml 0.9%氯化鈉注射液，充分振蕩、混勻。大鼠麻醉后，仰臥位固定于木板上，剃去左右膝關節腔周邊1cm區域腿毛，絡合碘消毒，體積分數75%乙醇脫碘，大鼠屈曲45°，以髕骨下極髕腱外緣為進針點，向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回撤2mm，注入0.2ml配制好的木瓜蛋白酶0.9%氯化鈉注射液（在第1、3、5天各1次），2周后KOA模型建立[7]。空白組：大鼠不造模、不給藥。4周治療組：造模成功后，大鼠灌胃舒尼替尼（1mg/kg，100mg溶于100ml的0.9%氯化鈉溶液中，1ml/kg），1次/d，持續4周。8周治療組：造模成功后，大鼠灌胃舒尼替尼（1mg/kg，100mg溶于100ml的0.9%氯化鈉溶液中，1ml/kg），1次/d，持續8周。對照組：造模成功后，大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液（1ml/kg），1次/d，持續8周。

1.2 主要試劑及器材 木瓜蛋白酶（P3250-25g，規格25g，美國 Sigma公司）、舒尼替尼（HY-10255A，規格200mg，美國MCE公司）、ELISA試劑盒（武漢新啟迪生物科技有限公司）、電子恒溫箱（HPX-9052 MBE，上海博迅實業有限公司）、臺式離心機（SORVALL，德國Heraeu公司）、酶標儀（DNM-9602，北京普朗新技術有限公司）。

1.3 關節液VEGF、IL-6、IL-33表達水平的檢測 實驗結束后（第8周）脫頸處死大鼠，切開雙膝關節腔，用1ml 0.9%氯化鈉溶液沖洗關節腔并收集為關節液標本，4 000r/min離心5min，提取上清液，置于-20℃冰箱內密封保存。采用ELISA法檢測大鼠關節液VEGF、IL-6、IL-33表達水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠關節液VEGF表達水平比較 4周治療組、8周治療組、對照組和空白組大鼠關節液VEGF表達水平分別為（168.43±47.47）、（136.75±27.48）、（237.95±69.10）、（152.26±31.17）pg/ml，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，4周治療組、8周治療組大鼠關節液VEGF表達水平均明顯低于對照組（均P＜0.05），8周治療組大鼠關節液VEGF表達水平明顯低于4周治療組（P＜0.05）。提示舒尼替尼能降低大鼠關節液VEGF表達水平，長時間用藥能使關節液VEGF維持在較低水平。

2.2 4組大鼠關節液IL-6表達水平比較 4周治療組、8周治療組、對照組和空白組大鼠關節液IL-6表達水平分別為（36.88±9.81）、（33.16±5.51）、（41.13±13.12）、（26.92±9.40）pg/ml，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，8周治療組大鼠關節液IL-6表達水平明顯低于對照組、4周治療組（均P＜0.05），4周治療組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。提示舒尼替尼長時間用藥能降低大鼠關節液IL-6表達水平。

2.3 4組大鼠關節液IL-33表達水平比較 4周治療組、8周治療組、對照組和空白組大鼠關節液IL-6表達水平分別為（40.36±14.75）、（35.22±9.13）、（53.68±21.73）、（25.88±11.39）pg/ml，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，4周治療組、8周治療組大鼠關節液IL-33表達水平均明顯低于對照組（均P＜0.05），8周治療組大鼠關節液IL-33表達水平明顯低于4周治療組（P＜0.05）。提示舒尼替尼能降低大鼠關節液IL-33表達水平，長時間用藥可持續降低關節液IL-33表達水平。

3 討論

KOA是一種退行性疾病，以關節軟骨退行性變、骨贅形成、滑膜炎癥為主要特征，常見于中老年人。在嚴重情況下，關節周圍的骨及軟組織結構發生改變，可能導致關節疼痛、腫脹、畸形或殘疾[8]。目前關于KOA病因及發病機制尚未完全闡明。KOA進展可能與炎癥有關，而所有關節炎癥的共同特征是滑膜炎。

滑膜中新生血管增多，VEGF表達水平上升均與滑膜炎有關。VEGF家族是一類多功能的細胞因子，在血管及淋巴管生成中具有直接或間接的調控作用，可促進內皮細胞增殖及血管生成，增加血管通透性[9]。此外，VEGF是骨發育的重要介質。當VEGF發生作用時，新生神經及血管一同進入軟骨、新生骨贅中，促進骨膜炎癥的浸潤，從而加重患者疼痛感[10-11]。新生血管刺激炎癥反應生成，而炎癥反應又促進血管生成；在這過程中，VEGF起著重要作用[12]。同時，VEGF還能上調關節軟骨細胞MMP表達水平，從而導致軟骨變性。IL-6是一種促炎癥因子，它在KOA患者中表達水平明顯上升[13-14]。IL-6由軟骨細胞和滑膜成纖維細胞分泌并交叉調節介導[15]，可誘導IL-1增加MMP的合成，抑制蛋白多糖產生[16]。IL-33是IL-1受體家族成員ST2的唯一已知配體，它通過與ST2的結合來參與活化MyD88/NF-κB信號通路，誘導肥大細胞、Th2細胞因子產生。ST2/IL-33信號通路參與多種炎癥免疫過程并起著關鍵作用。

舒尼替尼是一種多靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑，其作用靶點包括 PDGFR（PDGFRα、PDGFRβ）、VEGFR（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）等。舒尼替尼能阻斷這些信號通路，目前被廣泛用于抗腫瘤治療的實驗。本實驗結果顯示，舒尼替尼能降低大鼠關節液VEGF表達水平；長時間用藥能使關節液VEGF維持在較低水平，且降低IL-6、IL-33表達水平。

綜上所述，舒尼替尼對KOA大鼠模型具有治療作用，本研究結果為舒尼替尼作為防治KOA的新型藥物提供了實驗基礎。