調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在移植物抗宿主病免疫治療中的研究進(jìn)展

于吉峰

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科鄭州450052

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)是異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后供者免疫活性細(xì)胞介導(dǎo)的攻擊宿主細(xì)胞和器官的一種過度炎癥反應(yīng)，它是allo-HSCT后最常見的并發(fā)癥，也是影響移植效果的主要障礙［1］。調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+T細(xì)胞亞群，自從被Sakaguchi等［2］發(fā)現(xiàn)以來，一直是免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。Tregs通過細(xì)胞間直接接觸并分泌抑制性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)一步抑制Th1和Th17細(xì)胞;Tregs是維持自身免疫耐受與T細(xì)胞免疫穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，它在維持機(jī)體免疫穩(wěn)定、預(yù)防自身免疫性疾病方面具有重要作用［3-7］。近年來 CD4+CD25+Foxp3+Tregs在allo-HSCT后GvHD免疫調(diào)節(jié)中的作用成為研究熱點，本文就Tregs在GvHD免疫治療中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Tregs的分類及與GvHD治療的關(guān)系

1995年 Sakaguchi等［2］在小鼠外周血中發(fā)現(xiàn)5% ～10%的CD4+T細(xì)胞高表達(dá)IL-2受體CD25，因具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)功能而被命名為Tregs。隨后又發(fā)現(xiàn)了特異性表達(dá)于Tregs中的Foxp3，其轉(zhuǎn)錄因子與Tregs表面多種膜蛋白如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)基因(glucocorticoid-induced TNF receptor，GITR)、CD22、CD103、CD44 的表達(dá)關(guān)系密切［3］。Foxp3對Tregs免疫抑制因子的分泌有重要的調(diào)控作用，因此將其作為區(qū)分Tregs和普通T細(xì)胞的特異性標(biāo)志。目前對于Tregs細(xì)胞亞群的分類命名尚不統(tǒng)一。Tregs按其來源不同可以分為占Tregs絕大部分的胸腺來源的Tregs(tTregs)，又稱為天然型 Tregs(nTregs)和外周型 Tregs(pTregs)，pTregs又稱誘導(dǎo)型 Tregs(iTregs)［3］。

GvHD的特征是免疫系統(tǒng)中效應(yīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的失衡，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子過度產(chǎn)生。HSCT前的預(yù)處理方案包括照射或化療可引起宿主器官損傷而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放。這些細(xì)胞因子刺激宿主抗原呈遞細(xì)胞，將宿主抗原多肽呈遞給供體移植物中的T細(xì)胞，致使T細(xì)胞將其識別為外來抗原，導(dǎo)致移植后T細(xì)胞活化。供體的幼稚T細(xì)胞經(jīng)刺激后分化為產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)T細(xì)胞，主要為CD4+T細(xì)胞的Th1或Th17類型細(xì)胞及CD8+效應(yīng)細(xì)胞的Ⅰ型細(xì)胞毒性T細(xì)胞。細(xì)胞因子風(fēng)暴和組織損傷引起趨化因子介導(dǎo)的連鎖反應(yīng)形成正反饋回路，致使更多的效應(yīng)細(xì)胞如細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被募集，導(dǎo)致腸道、肝臟和皮膚等器官損傷。幼稚T細(xì)胞在IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子β(transfecting growth factorβ，TGF-β)作用下優(yōu)先分化為效應(yīng)性T細(xì)胞，從而導(dǎo)致Tregs數(shù)量減少。此外，IL-6能夠通過激活Toll樣受體來抑制nTregs的抑制功能從而導(dǎo)致Tregs細(xì)胞功能進(jìn)一步減弱［4］。

nTregs通過接觸和非接觸依賴性機(jī)制介導(dǎo)其免疫抑制功能。接觸依賴性機(jī)制涉及免疫抑制分子的表達(dá)，如CTLA-4、淋巴細(xì)胞激活基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)和神經(jīng)降壓素-1，這些免疫抑制分子能抑制共刺激標(biāo)志物導(dǎo)致T細(xì)胞增殖減少。非接觸依賴性的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制涉及多種細(xì)胞因子的分泌，如 IL-10、TGF 和 IL-35［5］，該研究證實供體移植物中Tregs數(shù)量增多可以降低GvHD相關(guān)的風(fēng)險，而allo-HSCT后早期nTregs降低與GvHD風(fēng)險增加有關(guān);活動期慢性GvHD患者中Tregs數(shù)量比健康志愿者明顯減少，說明GvHD可能和Tregs的缺乏有關(guān);細(xì)胞毒性T細(xì)胞除了介導(dǎo)GvHD，還具有移植物抗腫瘤效應(yīng)(graft-versus-tumor，GvT)，因此抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性可能會消除GvT效應(yīng)。體外研究［6］已證明nTregs不抑制激活的同種異體CD8+T細(xì)胞并保留其殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，因此nTregs細(xì)胞可以在保持GvT功能的同時減輕GvHD作用，這使其成為過繼細(xì)胞輸注治療的良好選擇。

研究［5］顯示 T效應(yīng)細(xì)胞和 Tregs比率需要在1∶1到1∶3的情況才能顯著降低小鼠GvHD。新的研究［6］發(fā)現(xiàn)通過體內(nèi)刺激或體外擴(kuò)增等方法能夠成功擴(kuò)增nTregs，將其輸注于人體用于預(yù)防和治療GvHD，并不增加疾病復(fù)發(fā)或繼發(fā)感染的風(fēng)險。

2 Tregs在GvHD治療中的可行性和安全性

采用過繼Tregs細(xì)胞療法已經(jīng)證明體外擴(kuò)增的T細(xì)胞在預(yù)防GvHD方面是有效的，可以安全地輸注于人體內(nèi)，減少GvHD的發(fā)生而且不增加復(fù)發(fā)風(fēng)險。

來自波蘭的學(xué)者［8］于2009年發(fā)表了第一篇用體外擴(kuò)增的Tregs輸注的研究報告。作者采用體外擴(kuò)增的CD4+CD25+CD127－T細(xì)胞移植治療1例急性GvHD和1例慢性GvHD，由于是首次臨床試驗，患者數(shù)量有限，Tregs臨床應(yīng)用的安全性未知。截至2019年3月底，共有17項在NIH臨床試驗網(wǎng)站上登記注冊的Tregs用于GvHD的臨床試驗，其中有3項已經(jīng)完成，4項被暫停或召回，10項正在進(jìn)行中。已經(jīng)完成的3項臨床試驗證實了Tregs輸注的安全性和可行性。

2011年 Brunstein等［9］發(fā)表了臍帶血擴(kuò)增的Tregs臨床Ⅰ期試驗結(jié)果，該研究證明了23例急性GvHD患者使用臍帶血Tregs的安全性和可行性。另有臨床試驗［10］結(jié)果表明磷酸化STAT3+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與供體T細(xì)胞活化和急性GvHD發(fā)生率密切相關(guān)。另外，優(yōu)化IL-2劑量可克服可溶性IL-2受體對細(xì)胞因子的阻斷，在同種異體移植后使Tregs存活更久，靶向抑制STAT3可以預(yù)防GvHD。最近有學(xué)者［11］首次采用異基因Tregs過繼輸注和低劑量IL-2聯(lián)合治療5名對常規(guī)治療無效的慢性GvHD患者，結(jié)果顯示所有患者均耐受Tregs輸注，血液中循環(huán)Tregs數(shù)量增加，GvHD病情得到改善或保持穩(wěn)定。

3 Tregs在GvHD防治中的體內(nèi)擴(kuò)增

Tregs需要 IL-2和抗原呈遞細(xì)胞(dendritic cells，DCs)的T細(xì)胞受體以及共刺激信號的共同作用才能達(dá)到最佳增殖狀態(tài)。研究［7］證明，在慢性GvHD小鼠模型中采用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)治療后可增加Tregs數(shù)量，調(diào)節(jié)外周淋巴結(jié)的Th1和Th17反應(yīng)，使皮膚型慢性GvHD癥狀減輕;Tregs對慢性GvHD的抑制作用取決于Tregs與傳統(tǒng)T細(xì)胞比率的增加，而不是抑制功能的增強(qiáng)。

由于nTregs表達(dá)高水平IL-2受體α，用超低劑量IL-2就可以在體內(nèi)使nTregs選擇性擴(kuò)增;由于是超低劑量，因此不足以刺激T效應(yīng)細(xì)胞［12-13］。有學(xué)者［12］前瞻性地用超低劑量IL-2(100 000～200 000 IU/m2)治療16名兒童GvHD患者，每周3次，從移植后第7～30天開始，持續(xù)至12周，結(jié)果顯示接受超低劑量IL-2治療的患者中無3～4級毒性反應(yīng)，且經(jīng)IL-2治療6周后，患者Tregs的平均比例從治療前的4．8%增加到11．1%，所有接受IL-2治療的患者均未發(fā)生2～4級急性GvHD，而對照組發(fā)生率則為12%;此外，接受IL-2治療的患者病毒感染的發(fā)生率(15%)也低于對照組(63%)。以上研究結(jié)果顯示體內(nèi)Tregs擴(kuò)增可產(chǎn)生足夠的nTregs，從而減少GvHD的發(fā)生，與T細(xì)胞體外擴(kuò)增相比，相對便宜，不需要大量的細(xì)胞分選和細(xì)胞培養(yǎng)。另有研究［13］證實低劑量IL-2治療難治性慢性GvHD也有效。35例由于應(yīng)用激素導(dǎo)致的難治性慢性GvHD患者每天給予1×106IU/m2的IL-2治療12周后，Tregs水平比治療前增加了5倍，而傳統(tǒng)T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞無顯著變化。

最近一項利用對溴代嗎啡和外末端蛋白(bromomorphine and extrinsic protein，BET)為靶點來限制促炎細(xì)胞因子的BET抑制劑(BETi)的研究［14］結(jié)果表明，在Allo-HSCT后聯(lián)合使用BETi與Tregs可以改善GvHD癥狀;采用類腫瘤壞死因子配體1a和免疫球蛋白復(fù)合體(TL1a-Ig)和低劑量IL-2分別靶向TNF Rsf25和CD25，可以顯著擴(kuò)增并選擇性激活Tregs，使其功能明顯增強(qiáng);移植后的受體小鼠經(jīng)過TL1a-Ig、IL-2聯(lián)合 EP11313(一種 BETi)治療 7 d后，腫瘤壞死因子和干擾素的水平明顯降低。此外用體內(nèi)擴(kuò)增供體Tregs對Balb/c小鼠進(jìn)行MHC不匹配的B6小鼠異基因骨髓移植，結(jié)果顯示在接受擴(kuò)增Tregs聯(lián)合EP11313治療的異基因骨髓移植小鼠中，移植后早期脾臟和淋巴結(jié)中的CD4/CD8比值改善，T效應(yīng)細(xì)胞減少，Tregs水平升高，GvHD癥狀減輕，皮膚和眼部的受累癥狀減輕。

另有研究［15］針對TNFRSF25和CD25兩個受體對HSCT后的Balb/c小鼠的Tregs進(jìn)行體內(nèi)擴(kuò)增治療GvHD，與HSCT同時使用環(huán)磷酰胺和體內(nèi)擴(kuò)增Tregs移植的小鼠相比，這兩種方案都可以使GvHD癥狀減輕，長期生存率提高，在HSCT 3個月后，接受環(huán)磷酰胺和Tregs體內(nèi)擴(kuò)增治療的小鼠均表現(xiàn)出對同種異體皮膚移植的耐受性和相關(guān)的免疫功能恢復(fù)，但是僅給予Tregs體內(nèi)擴(kuò)增的小鼠在HSCT后早期體重降低較少，胸腺損傷更小，因此，體內(nèi)擴(kuò)增Tregs可以作為預(yù)防GvHD的一個很有價值的治療方案。

4 Tregs在GvHD防治中的體外擴(kuò)增

與成人T細(xì)胞相比，臍帶血中T細(xì)胞含有較高比例的CD4+CD25+亞群，而且大多數(shù)是幼稚T細(xì)胞，經(jīng)刺激后不易成為效應(yīng)性T細(xì)胞。因此，臍帶血是Tregs體外擴(kuò)增的重要來源。Brunstein等［9］首次在成人雙臍帶血移植中使用臍血擴(kuò)增的Tregs進(jìn)行臨床試驗，從部分HLA匹配的臍血中分離的Tregs經(jīng)抗CD3及抗CD28單抗刺激擴(kuò)增后輸注;在23例接受劑量為30×105個/kg Tregs輸注的患者中，17(74%)例Tregs增加，中位數(shù)擴(kuò)張211倍;所有擴(kuò)增后的Tregs在體外均具有抑制作用，中位抑制率為86%，且未發(fā)現(xiàn)輸液毒性;臍帶血Tregs在移植后14 d內(nèi)均可以檢測到，其中大部分受試者Tregs數(shù)的峰值出現(xiàn)在移植后第2天。與108例對照組患者相比，Tregs組2～4級急性GvHD發(fā)生率(43%vs 61%)降低，但2組在復(fù)發(fā)、感染和早期死亡率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

另有研究［16］報告了5例接受臍帶血Tregs移植的患者(2例雙臍帶血移植;3例外周血匹配的非相關(guān)供體移植)在供體移植前1天接受了臍帶血Tregs(劑量1×106個/kg)輸注，結(jié)果顯示所有患者均無輸液反應(yīng)。患者臍帶血移植后細(xì)胞植入成活的中位數(shù)為13(8～17)d。移植后患者血漿中的IL-10水平在第7天和第21天出現(xiàn)雙峰。所有患者的血漿IL-2水平顯著下降。所有患者均發(fā)生過2級以上的急性GvHD。移植后第7天檢測慢性GvHD生物標(biāo)志物(Reg3a和Elafin)時未觀察到增加。

對Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TR1)在急性GvHD小鼠模型中作用的研究［17］發(fā)現(xiàn)，用維生素D3和地塞米松誘導(dǎo)小鼠CD4+T細(xì)胞體外分化為TR1，并在骨髓移植當(dāng)天注入供者源性TR1，與GvHD組比較，TR1輸注組小鼠體重減輕幅度減小，生存率提高2倍，組織病理學(xué)分級降低。

有學(xué)者［18］建立了一個產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量規(guī)范兼容擴(kuò)增方案，可提高臨床試驗的Tregs的數(shù)量和純度。該方案采用6個臨床級操作程序分離Tregs后，用大劑量IL-2、抗CD3/抗CD28 T細(xì)胞受體刺激和雷帕霉素擴(kuò)增19 d，平均擴(kuò)增 8．5(6．3 ～13．7)倍。培養(yǎng)期間Foxp3的表達(dá)穩(wěn)定，而CD127的表達(dá)降低;體外抑制試驗也表明擴(kuò)增后的Tregs通過常規(guī)T細(xì)胞(Tcons)對白血病細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。該方案為大劑量Tregs/Tcons臨床治療高危/復(fù)發(fā)/難治性白血病患者提供了良好的擴(kuò)增方法。

另有研究［19］用阿扎胞苷/地西他濱體外處理人外周血T細(xì)胞，分析HLA-G表達(dá)及其體外抑制特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低甲基化藥物(HA)治療通過HLA-G近端啟動子的低甲基化誘導(dǎo)T細(xì)胞上HLA-G的重新表達(dá)。HA誘導(dǎo)后的CD4+HLA-G+T細(xì)胞表現(xiàn)為Foxp3陰性，在體外具有很強(qiáng)的抑制性細(xì)胞的功能。該細(xì)胞在TNF存在下可保持其抑制功能，并在阿扎胞苷預(yù)處理后將低甲基化維持至少2 d，因此體外通過藥物低甲基化可產(chǎn)生表達(dá)HLA-G的一個Tregs亞群，純化后可用于過繼免疫治療。

體外Tregs的擴(kuò)增中一個很重要的問題是細(xì)胞的純度。使用免疫磁珠分離Tregs有可能被T效應(yīng)細(xì)胞污染［20］。使用雷帕霉素可以減少T效應(yīng)細(xì)胞的不良擴(kuò)增和增加擴(kuò)增的Tregs的穩(wěn)定性。經(jīng)過修改體外擴(kuò)增程序后能夠產(chǎn)生高達(dá)100×106個/kg的臍帶血 Tregs數(shù)量［21］。

5 Tregs研究新進(jìn)展

有學(xué)者［22］已經(jīng)成功地從切除的兒童胸腺中分離出Tregs。與pTregs相比，這些 nTregs有以下優(yōu)點:數(shù)量多，單個胸腺中Tregs的產(chǎn)量超過了平均成人循環(huán)血中的Tregs數(shù)量;Tregs擴(kuò)增后比血源性的Tregs有更強(qiáng)的抑制功能和穩(wěn)定性。此外，有關(guān)Tregs細(xì)胞治療的另一個進(jìn)展是開發(fā)了用于臨床的Tregs細(xì)胞分選機(jī)。使用此機(jī)器可獲得不同的Tregs亞組:CD4+CD25+CD127－CD45RA+的幼稚 T細(xì)胞、在炎癥條件下表現(xiàn)出更穩(wěn)定和功能更強(qiáng)的CD4+CD25+CD127－CD39hiTregs［23］、CD4+CD25+CD127－CD226－Tigit+的不穩(wěn)定型 Tregs［24］。這些結(jié)果為Tregs的下一步臨床研究提供了細(xì)胞來源和分離方法。

6 未來的研究方向

Tregs的發(fā)現(xiàn)加深了人們對GvHD免疫機(jī)制的了解，推動了其免疫治療的進(jìn)程。越來越多的研究證明，即使在應(yīng)用大劑量藥物的情況下，Tregs也有良好的臨床耐受性。目前臨床中常規(guī)應(yīng)用Tregs的主要障礙在于它在循環(huán)中的數(shù)量低，需要擴(kuò)增，擴(kuò)增后的細(xì)胞不穩(wěn)定以及體外擴(kuò)增后由于細(xì)胞純度問題對促炎微環(huán)境的抑制。應(yīng)用體外擴(kuò)增技術(shù)生產(chǎn)足夠數(shù)量的Tregs需要專業(yè)技術(shù)以及昂貴的細(xì)胞分選和培養(yǎng)方法，進(jìn)一步生產(chǎn)出“成品”Tregs尚需時日。目前體內(nèi)nTregs擴(kuò)增具有成本低、效益更高、更容易實施的優(yōu)點，比體外Tregs擴(kuò)增更有利于廣泛的臨床應(yīng)用。

總之，對于GvHD，Tregs是一種很有前途的細(xì)胞免疫治療方法。臨床前期試驗和初步臨床數(shù)據(jù)表明Tregs對急性和慢性GvHD有效。未來對Tregs進(jìn)一步的研究將會集中在以下幾個方面:細(xì)胞來源、分離方法、輸注劑量、輸注時機(jī)、最佳免疫抑制方案和輸注后的細(xì)胞歸宿。