惡性腫瘤免疫生物治療的現狀及展望

王青青 熊佳

2018年，美國德克薩斯大學安德森癌癥中心的詹姆斯·艾莉森（James P.Allison）教授與日本京都大學的本庶佑（Tasuku Honjo）教授因新型癌癥免疫治療方法（針對負性免疫調節創立治療腫瘤的新方法）獲得了諾貝爾生理學或醫學獎。這一成果充分體現了基于免疫學原理的新策略在治療腫瘤方面取得的重大進展，為惡性腫瘤防治手段的革新帶來了新的思路，也預示著腫瘤免疫生物治療的巨大前景。

由于腫瘤學、免疫學以及分子生物學等相關學科的理論和技術快速發展和交叉滲透，隨著對機體抗腫瘤免疫應答和腫瘤免疫逃逸機制的深入認識，免疫治療的新策略和新思路得到進一步的研究、拓展，免疫療法受到前所未有的重視。一直以來，研究主要集中在增強免疫的機制上，但“免疫增強化”策略通常無法達到客觀緩解，并有頻繁的免疫相關不良事件（immune-related adverse events，irAEs）發生。而針對程序性死亡受體-配體 1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1，B7-H1）/程序性死亡受體 1（programmed cell death protein 1，PD-1）途徑的腫瘤免疫療法在患者中取得了更高的客觀緩解，且irAEs少得多，其原因是作用機制的不同，此機制是選擇性地恢復腫瘤微環境中由腫瘤引起的免疫缺陷，這里稱為“免疫正常化（immune normalization）”，此概念由美國耶魯大學陳列平教授首次提出[1]。“免疫正常化”主要根據腫瘤免疫逃逸機制，靶向腫瘤微環境，治療效果更加有效且毒性更低。

免疫正常化的概念強調了確定腫瘤進展過程中免疫應答特定的缺陷或功能障礙的重要性，進而尋找策略糾正這些缺陷，以恢復機體正常的抗腫瘤免疫功能。雖然免疫正常化的過程中可能導致免疫增強，但這種增強應該是在不對正常器官/組織造成永久性損傷的范圍內短暫地可控性波動。如果把免疫應答看成一根大水管，正常情況下是有適當排放的，如果管道被堵塞將無法正常排水。“免疫增強化”的方法可以被理解通過增加管道前端壓力，迫使排水進行，但可能伴有加壓過度后管道破裂的風險。而“免疫正常化”方法可以理解為通過識別并移除阻塞以恢復正常水流、且不會危及管壁的策略。免疫正常化策略可圍繞以下幾個方面展開：瞄準腫瘤誘導的免疫逃逸機制，選擇性調整腫瘤免疫微環境中的應答，重塑腫瘤微環境中的免疫能力。

近年來備受關注的創新性的腫瘤免疫生物治療手段主要包括檢查點分子阻斷、嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）、腫瘤治療性疫苗等。2013年，Science雜志將腫瘤免疫治療列十大科學突破的首位[2]，本文就當前惡性腫瘤免疫生物治療的主要進展與面臨的挑戰加以概括和評述。

1 檢查點阻斷的免疫治療

T細胞激活和發揮效應需要表面共刺激分子如CD28等提供活化信號。相反，T細胞表面還有若干共抑制分子，也被稱為檢查點（checkpoint），當其和相應配體結合后，傳遞的信號能夠抑制T細胞活化，導致T細胞增殖、細胞因子分泌和對腫瘤細胞的殺傷功能下調，避免過度活化，維持免疫穩態[3]。腫瘤環境中腫瘤抗原特異性T細胞往往高表達檢查點分子，處于失能狀態。基于這一原理，采用共抑制分子（或配體）的單克隆抗體來阻斷其信號，可以重新激活T細胞。細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4，CTLA-4）和 PD-L1（B7-H1）/PD-1是目前臨床上此類單抗最常用的靶分子，并在惡性黑色素瘤等類型腫瘤的臨床治療中顯示令人振奮的結果[3]。其中CTLA-4單抗Ipilimumab已被FDA批準用于治療晚期黑色素瘤；PD-1單抗Nivolumab和Pembrolizumab被FDA批準用于治療非小細胞肺癌和黑色素瘤。同時，以上3種單抗用于頭頸癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、尿路上皮癌以及小細胞肺癌治療的臨床試驗正在進行中。除此之外，CTLA-4單抗Tremelimumab、PD-1 單抗 Pidilizumab、B7-H1 單抗MPDL3280A以及BMS936559等均處于不同階段的臨床試驗中。針對其他共抑制分子如OX40、4-1BB的單抗也在研發之中[4-5]。FDA目前批準上市3種PD-L1單抗，包括用于局部晚期或轉移性尿路上皮癌和非小細胞肺癌的 Tecentriq（Atezolizumab）[6-7]和 Imfinzi（Durvalumab）[8-9]以及治療晚期或轉移性尿路上皮癌以及轉移性 Merkel皮膚細胞癌的 Bavencio（Avelumab）[10-11]。

最近的研究還揭示了腫瘤微環境中檢查點分子的表達調控機制，可為未來治療提供更多的潛在靶點。正常情況下，T細胞中 E3泛素連接酶F-box protein 38（FBXO38）介導對PD-1的K48多聚泛素化降解，使PD-1表達維持在較低水平，保證T細胞發揮正常功能。FBXO38在腫瘤浸潤T細胞中低表達，導致PD-1高表達，產生免疫抑制[12]。在腫瘤微環境中，外泌體（exosome）在腫瘤細胞與免疫細胞之間發揮重要的信號傳遞功能[13-14]，是由細胞釋放的雙層膜結構囊泡狀小體，直徑在30～100nm不等，可包裹多種生物活性分子如蛋白質、核酸、脂質等[15]。黑色素瘤細胞分泌PD-L1陽性的外泌體到腫瘤微環境和血液循環中，外泌體上PD-L1與T細胞表面PD-1結合，抑制T細胞增殖和功能，阻斷抗腫瘤免疫，抑制腫瘤細胞產生外泌體PDL1能夠消除其對抗腫瘤免疫的抑制[16-17]。

除了CTLA-4和PD-1/PD-L1，在腫瘤免疫中發揮關鍵作用的新檢查點分子不斷被鑒定，有望成為免疫治療的新靶標。Siglec-15是一個唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素家族基因，正常僅在髓系細胞表達，腫瘤發生時Siglec-15在肺癌、卵巢癌和頭頸癌等多種腫瘤細胞以及腫瘤微環境中的M2型巨噬細胞中表達上調，且其表達與B7-H1（PD-L1）是互斥的。研究表明，Siglec-15在體內外均能抑制抗原特異性T細胞反應，可作為免疫正常化策略的潛在靶點。目前Siglec-15單克隆抗體（NC318）用于人實體腫瘤治療的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NC03665285）正在進行[18]。

TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）是T細胞激活后誘導表達的一類抑制分子。在腫瘤發生時，TIM-3會在衰竭T細胞及腫瘤浸潤的樹突狀細胞中表達，通過減少死亡腫瘤細胞核酸的免疫原性抑制天然免疫。研究發現TIM-3和另一種表達在活化T細胞并參與T細胞抑制的分子CEACAM-1（carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1）所組成的異源二聚體對于TIM-3發揮抑制功能至關重要，對TIM-3和CEACAM-1的共阻遏會增強結腸癌小鼠模型的抗腫瘤應答[19]。

淋巴細胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3，CD223）是一個在活化T細胞上發現的跨膜蛋白，作為受體傳遞抑制性信號，負調控CD4+和CD8+T細胞的增殖、活化、效應功能及其穩態。纖維介素蛋白1（fibrinogen-like protein 1，FGL1）是 LAG-3的一個重要的功能性配體，FGL1-LAG-3相互作用是獨立于B7-H1/PD-1通路的另一條腫瘤免疫逃逸通路，阻斷這條通路能和抗PD-1治療起到協同作用[20]。

TIGIT（T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain）作為一個新興的抑制性受體，在自然殺傷性細胞（natural killer cell，NK）高表達，靶向TIGIT的檢查點免疫治療能夠逆轉NK細胞的功能耗竭、增強NK細胞介導的抗腫瘤免疫應答、有效抑制小鼠腫瘤生長、延長荷瘤小鼠生存[21]。

靶向共抑制分子的單抗療法是通過活化T細胞來達到殺傷腫瘤的目的，其缺陷之處在于無法專一地激活腫瘤特異性T細胞應答。治療所引發的多克隆T細胞活化給患者帶來一些不良反應，例如接受Ipilimumab治療的患者往往會呈現疲勞、腹瀉、皮疹、腸道炎性反應等不良反應，主要與CTLA-4在淋巴結中較高表達相關。有臨床試驗采用CTLA-4和PD-1單抗的聯合療法，雖然療效優于單獨使用，但有較為強烈的不良反應[22]。

2 嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）

CAR-T屬于過繼免疫治療（adoptive immunotherapy，AIT）。AIT是通過向腫瘤患者輸入經體外擴增和激活的免疫活性細胞如T細胞或NK細胞，達到殺傷腫瘤細胞的目的。常規AIT療法通常基于腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）或者細胞因子激活的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIKs），由患者的腫瘤組織分選出，在體外經過抗原特異性選擇、擴增、細胞因子誘導活化后回輸至患者體內[23]。這種策略雖有一定效果，但回輸的細胞在體內往往不能有效識別腫瘤，原因是腫瘤細胞通常低表達主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子從而逃避免疫細胞的識別。同時，腫瘤中的免疫抑制性微環境亦會降低回輸細胞的殺傷能力。CAR-T是基于改造T細胞抗原受體，使T細胞更加有效地識別腫瘤并活化，從而殺傷腫瘤的技術。目前第3代嵌合抗原受體主要包括以下成分：識別腫瘤抗原的抗體可變區（single chain variable fragment，scFv）、CD3-ζ鏈 或FcεRIγ 的胞內段、2 個共刺激分子（CD28、CD134）的胞內段。CAR-T相比于未經改造的T細胞具有3大優勢：（1）識別腫瘤抗原不受MHC分子的限制，解決腫瘤細胞由于MHC分子表達下調而產生的免疫逃逸問題；（2）由于具有免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）和共刺激分子的胞內段，CAR-T識別腫瘤抗原后增殖和產生細胞因子的能力更強；（3）既能識別蛋白類抗原，也能識別糖脂類抗原，能更加廣譜地殺傷腫瘤細胞。

CAR-T的概念自從1989年首次提出以來[24]，在治療血液系統腫瘤中取得突破性進展。Lee等[25]利用CD19-CART治療21例急性淋巴細胞白血病患者，觀察到67%的完全緩解率。隨后來自多個不同機構的數據顯示，CAR-T療法對急性淋巴細胞白血病患者能獲得60%～80%的緩解率，大大優于傳統的化療療效[26－27]。因此CAR-T技術在白血病治療領域是具有革命性意義的重大突破[28]。然而面臨的挑戰也巨大，主要體現在以下3個方面：（1）在實體瘤治療方面困難重重。目前臨床上 CAR-T 療法的 3個靶分子（CD19、CD20、CD22）均是針對B細胞，而絕大多數實體瘤不具備理想的靶向抗原。CAR-T在應用于實體瘤治療時還面臨T細胞無法有效浸潤、腫瘤內部免疫抑制性微環境等困難。（2）不良反應不可忽視。CAR-T治療的不良反應主要來自于T細胞活化、殺傷過程中釋放大量細胞因子，嚴重時需要用白細胞介素6（Interleukin 6，IL-6）中和抗體Tocilizumab來降低不良反應。CAR-T在治療白血病的同時也摧毀正常的B細胞，患者需注射丙種球蛋白來維持正常免疫功能。此外，CAR-T治療有時會產生脫靶效應，導致患者正常組織細胞被損傷[29]。（3）治療費用十分高昂。2017年，美國FDA批準諾華（Novartis）旗下CAR-T療法藥物Tisagenlecleucel（CTL019）上市，商品名為Kymriah，用于治療復發/難治25歲以下B細胞急性淋巴性白血病（B-ALL）患者，3個月內的總體緩解率為83%。根據ClinicalTrials.gov網站顯示，目前臨床在研的CAR-T項目涉及靶點40種以上，主要包括CD19、CD20、CD22、Glypican-3（GPC3）、B-Cell Maturation Antigen（BCMA）等。

CAR-T細胞的胞啃作用（trogocytosis）是CAR-T治療后腫瘤細胞表面抗原載量降低的機制。在急性淋巴細胞白血病NALM6小鼠模型中，腫瘤細胞表面的CD19抗原轉移到CAR-T細胞表面，導致了腫瘤細胞CD19抗原可逆性丟失，引起了CAR-T細胞之間的相互攻擊，從而導致T細胞耗竭和活性降低，當腫瘤細胞表面抗原密度降低到一定程度，CAR-T細胞表現出無免疫應答的狀態。利用不同的CAR-T細胞協同治療可以抵消胞啃作用導致的腫瘤免疫逃逸，顯著提升CART免疫療法的治療效果。CAR-CD19-CD28-T細胞和CAR-CD19-4-1BB-T細胞對于腫瘤細胞表面抗原密度的敏感性不同，兩者聯合應用在動物實驗中被證明是最優的搭配方案[30]。

3 腫瘤治療性疫苗

隨著高通量測序技術、組學技術的蓬勃發展，研究者將腫瘤免疫治療的目光放到了本身突變基因上，根據這些個體突變基因，設計個性化治療性疫苗，以期實現對腫瘤的精準治療。腫瘤治療性疫苗包括：多肽疫苗、信使RNA疫苗、DNA質粒疫苗、病毒載體疫苗、體外負載抗原的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）疫苗[31]等。DC是人體內已知功能最強大的專職抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC），腫瘤DC疫苗的原理是將腫瘤特異性抗原（tumor-specific Antigen，TSA）或者腫瘤相關性抗原（tumor-Associated antigen，TAA）導入DC，經DC提呈給腫瘤特異性T淋巴細胞并使之活化，從而殺傷腫瘤。前列腺癌治療性DC疫苗Sipuleucel-T（ProvengeR）于2010年經FDA批準上市，Sipuleucel-T針對前列腺癌細胞表達的前列腺酸性磷酸酶，將此抗原肽負載至樹突狀細胞，并輸入體內活化相應的T細胞，達到殺傷腫瘤細胞的目的[32]。

2015年，美國FDA批準了首個治療黑色素瘤的溶瘤病毒類疫苗talimogene laherparepvec（T-VEC,or Imlygic）。T-VEC是一種經過基因修飾的1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus 1，HSV-1），在腫瘤中復制并表達免疫激活蛋白粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GMCSF），它的使用可促使腫瘤細胞溶解，釋放出腫瘤源性抗原和GM-CSF，增強抗腫瘤的免疫應答。此外針對肺癌和黑色素瘤的疫苗MEGA-A3[33]，針對乳腺癌的疫苗Nelipepimut-S等均處于臨床試驗階段[34]。

2017年7月，Nature同期報道美國和德國兩個團隊所研發的基于腫瘤新抗原（neoantigen）的個性化疫苗的Ⅰ期臨床試驗結果。其中，美國哈佛大學團隊在20位局部晚期或者晚期的惡性黑色素瘤患者中找到了97個新抗原，并制備了個性化腫瘤疫苗，應用給相應的患者。在接受疫苗治療的6例患者中，4例患者在接受疫苗注射25個月后，未出現復發；另外2例出現復發的患者聯合PD-1抗體治療后均實現了腫瘤完全緩解，且在體內檢測到了針對新抗原的特異性T細胞[35]。德國的研究團隊利用新抗原制備RNA疫苗治療了13例惡性黑色瘤患者。所有患者體內都產生了針對新抗原的免疫反應，8例接受手術治療的局部晚期患者，疫苗的注射大幅度延長無復發的生存時間。5例晚期惡性黑色素瘤患者中，2例在單獨接受疫苗注射后，出現了腫瘤明顯縮小，達到了客觀有效；其中1例患者聯合PD-1抗體治療后，腫瘤完全緩解[36]。2018年，Nature再度報道2篇基于腦膠質瘤的腫瘤疫苗，德國的研究團隊利用腫瘤新抗原設計個性化腫瘤疫苗，治療難治性膠質瘤。新抗原疫苗注射后，80%的患者產生了免疫應答，腫瘤患者得到不同程度的緩解[37]。美國的研究團隊設計的疫苗，對8例患者實施治療，大多數患者體內均可觀察到針對新抗原的免疫應答[38]。

由于腫瘤抗原分子量小、免疫原性低等原因，所引發的特異性抗腫瘤免疫強度有限，研究人員通常會采取表位肽修飾、劑型改造等手段提升免疫效力[39]。磷脂酰乙醇胺結合蛋白4（phosphatidylethanolamine-binding protein 4，PEBP 4）作為一種抗凋亡蛋白表達在多種腫瘤細胞上，而在正常組織中低表達，由該蛋白來源的抗原肽，經氨基酸替換修飾，與HLA-A*0201分子結合，誘導具有殺傷作用的CTL細胞，以此修飾后的抗原肽類似物作為腫瘤疫苗，在小鼠模型中取得較好的抗腫瘤效果[40]。利用高密度脂蛋白模擬的納米圓盤負載抗原肽和佐劑能有效提升抗原/佐劑共呈遞至樹突狀細胞的能力，若采用多表位抗原肽疫苗，其抑制腫瘤的作用將更加強烈，此法與免疫檢查點抑制劑聯合使用，可能具有很好的前景[41]。瑞士洛桑聯邦理工學院研發了一種人工受體-extracellular vesicle-internalizing receptors（EVIR），能識別腫瘤來源外泌體中的腫瘤抗原。EVIR修飾的樹突狀細胞能夠捕獲來源于腫瘤的外泌體，并促進樹突狀細胞對該腫瘤抗原的識別，進而激活特異性抗腫瘤免疫應答[42]。

總體來說，除個別成功上市的疫苗，絕大多數腫瘤疫苗并不能取得臨床療效。即便有些患者對疫苗治療有反應性，但他們血液和腫瘤中抗原特異性T細胞的數量也很低[43]。另外，理想的TSA或TAA的尋找也是一大難題。因此腫瘤疫苗還存在非常多的技術和理論上的困難需要解決。

4 現實與展望

腫瘤生物學以及免疫學都極其復雜，當從免疫角度去審視并嘗試解決腫瘤問題的時候，會面臨諸多疑難和困惑，常會遇到無法解釋的現象和與預期相差甚遠的結果。其原因很大一部分在于目前對于腫瘤免疫的理論知識還知之甚少，仍需要利用更精確的手段深入研究關鍵的調控機制，更重要的是將這些研究成果整合成細胞、分子之間的網絡作用模式，實現這一目標將是個漫長并充滿挑戰的過程。

就目前腫瘤免疫治療的臨床應用方面，有許多問題仍亟待解決：（1）需要建立個體化治療策略，從而實現個體化精準治療；（2）需要建立合理的免疫治療評價標準，免疫治療需要建立相對獨立的一套評價體系來反映治療效果；（3）克服免疫耐受。突變的細胞發展成腫瘤的過程，也就是其逃避或打敗宿主免疫系統的過程，在利用活化免疫系統來治療腫瘤需要同時降低患者體內的免疫抑制環境，尤其是腫瘤組織內部的抑制性微環境；（4）降低治療成本。綜合治療是今后必然的發展方向。如何在綜合治療中充分利用免疫治療，和發展免疫治療策略具有同等重要的意義。對腫瘤免疫逃避的機制和腫瘤微環境的進一步深入認識的基礎上，腫瘤的免疫治療必將成為一個進展更加迅速的新興領域，在改善腫瘤的治療現狀中發揮不可替代的作用。