MicroRNA在心血管系統發育和疾病中作用的研究進展

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種單鏈、非編碼的內源性RNA，長度為18～25個核苷酸，通常在轉錄后負向調節基因的表達水平，通過與信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(3’-untranslated region，3’UTR)互補結合抑制mRNA翻譯或使其降解，最終引起基因沉默。miRNA在胚胎發育、細胞增殖和分化、凋亡、代謝及腫瘤發生等多種生理病理進程中均發揮重要作用[1]。與控制基因表達開關的轉錄調節子不同，miRNA常通過調控蛋白翻譯水平改變基因的表達[1]。一種miRNA可能通過調控細胞內多種功能相關的基因表達調控細胞發育過程，同時每個mRNA分子可能被多種miRNA調節[2]。從1993年秀麗隱桿線蟲中發現第一個miRNA-lin-4至今，人類基因組中已發現2 000余種miRNA。

1 miRNA的作用機制

在細胞基因組學中，miRNA基因屬于進化保守的一類，可獨立存在或形成多組分復合物存在，miRNA基因常作為獨立的轉錄單位進行轉錄。細胞核中，miRNA被RNA聚合酶Ⅱ轉錄為約幾千個堿基對的初始miRNA(pri-mRNA)；pri-mRNA被蛋白復合物Drosha剪切為約70個核苷酸的前體miRNA(pre-mRNA)；之后核輸出蛋白-5識別pre-mRNA，將其從細胞核運輸到細胞質中；細胞質內，pre-mRNA被RNase Ⅲ 內切酶Dicer剪切為近22個核苷酸的雙鏈miRNA[1]。其中一條先導鏈，參與RNA誘導的沉默復合體(RISC)合成，變為成熟miRNA；另外一條配對鏈，被降解或合并到細胞微泡中釋放到細胞外[3]。RISC效應器形成后，miRNA可與靶mRNA結合。RISC主要與mRNA的3’UTR序列結合，一旦miRNA-mRNA序列配對正確，RISC中具有核酸內切酶活性的Ago2蛋白剪切mRNA，導致其降解；miRNA與mRNA序列配對不完全時，miRNA的翻譯過程被抑制[1]。

2 miRNA在心血管發育中的作用

在心血管系統中，miRNA調控心肌細胞的生長和收縮、心律的發展與維持、脂質代謝和血管生成[4-6]。有研究通過對miRNA基因敲除從而阻斷心血管系統miRNA表達，有助于了解miRNA在心血管生物學中的重要性[4]。小鼠敲除Dicer/Drosha/Ago2等重要基因后，由于心臟和血管出現嚴重發展缺陷，早期胚胎階段即導致小鼠死亡[7]。

miRNA在不同類型細胞表達中具有差異性。心肌細胞含量最豐富的是miR-1，其中miR-1和miR-133由相同的雙順反子轉錄，但心肌細胞miR-133表達量低于miR-1。胚胎發育早期，miR-1和miR-133協同促進干細胞中胚層分化；發展后期，miR-1和miR-133發揮相反的作用：miR-1促進而miR-133抑制心肌細胞中胚層分化[8]。miR-1通過調節轉錄因子Irx5和Hand2表達影響心臟發育，靶向敲除miR-1導致室間隔缺損[9]。miR-133影響細胞周期蛋白D2和血清反應因子的活性，細胞周期蛋白D2通過作用于細胞G1期成視網膜瘤蛋白的磷酸化控制心肌細胞的增殖；血清反應因子負責調節心肌和平滑肌的分化和生長[10]。

心臟發育期間收縮蛋白的表達受到嚴格調控。肌球蛋白基因異常成為心室重構的病理基礎。肌球蛋白受控于miR-208a、miR-208b、miR-499這三種miRNA，它們分別存在于myh6(alpha-myosin heavy chain，α-MHC)，myh7(beta-myosin heavy chain，β-MHC)和myh7b的內含子中[8]。嚙齒類動物中，β-MHC在胚胎發育期間表達，α-MHC在出生后表達，myh7b在上述兩個階段均表達。miR-208a、miR-208b具有相同的種子序列，說明在不同發展階段它們調節共同的靶基因[11]。成年心臟中，在低氧或甲狀腺功能減退等環境下，心肌細胞β-MHC合成物重新表達。

3 miRNA在血管中的作用

作為血管壁的組分，內皮細胞和平滑肌細胞參與維持血管穩定。miRNA通過調節內皮細胞和平滑肌細胞的結構和功能，抑制炎癥反應及細胞增殖、遷移等促進血管穩定，減少動脈粥樣硬化的發生。

miR-10a通過調節黏附分子表達調控促炎內皮細胞表型，miR-10a敲除增強單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白介素(IL)-6、IL-8、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-選擇素等促炎介質合成，有研究發現，主動脈易發病區域miR-10a表達是降低的[5]。參與調節炎癥反應的其他miRNA分子包括miRNA Let-7g、miR-126等，miRNA Let-7g已被證明是一個重要的抗炎和抗老化分子，通過靶向抑制轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路和Sirt1(與細胞衰老相關)的相關基因，下調內皮細胞活化和老化[12]。miR-126在內皮細胞中高度表達，可減少黏附分子表達及血管內皮細胞和白細胞間的相互作用從而抑制炎癥反應[13]。

血管損傷引起平滑肌細胞的非正常收縮、增殖和擴張。miR-221通過抑制細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑p27及減少收縮基因α-平滑肌動蛋白(SMA)、平滑肌鈣調蛋白(CNN)表達，促進血管平滑肌細胞(VSMC)增殖[4]。Zhao等[14]研究指出，內皮細胞誘導平滑肌細胞miR-143/145的表達，miR-145通過靶向TGF-β受體Ⅱ，以可變方式調控TGF-β信號通路。細胞間接觸刺激后，由內皮細胞衍生的TGF-β介導miR-143及miR-145從平滑肌轉移到內皮細胞中。miR-143和miR-145分別靶向調節己糖激酶Ⅱ和整合素β-8，由此抑制內皮細胞形成毛細管樣結構，降低其增殖能力，維持血管穩定性[15]。

4 miRNA在心血管疾病中的作用

4.1 miRNA與高血壓 位于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)中miRNA靶基因在血壓調節中是非常重要。miR-155可調節血管緊張素Ⅱ1型受體(AGTR1)。AGTR1的表達量與miR-155呈負相關，與血壓呈正相關。中國倉鼠卵巢細胞miR-155抑制導致AGTR1的上調，且使細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)活化[16]。miR-155基因位于21號染色體上，三體化21號染色體與血壓降低有關，患有21三體綜合征同卵雙胞胎病人表現為AGTR1蛋白的低水平表達與miR-155的高水平表達[17]，說明miR-155通過對21號染色體的調控影響血壓水平。

L-精氨酸轉運體1(SLC7A1)參與內皮功能的紊亂及高血壓的發生。有研究發現，miR-122與SLC7A1基因的3’UTR序列有3個或4個潛在的結合位點。miRNA與3’UTR結合后，SLC7A1基因表達抑制，從而導致血管內皮功能紊亂，最終導致高血壓的發生和發展[18]。

4.2 miRNA與心力衰竭 近年來國內外研究者普遍認為，心力衰竭本質是一種分子-臨床綜合征，基因表達調控異常與HF的發病機制密切相關。肌質網Ca2+循環失調和心臟收縮功能受損是心力衰竭的一個重要標志，其原因可能是由于蛋白磷酸酶-1(PP-1)去磷酸化活性增加所致。Cai等[19]研究結果表明，心力衰竭時miR-765過表達，miR-765通過與蛋白酶抑制劑-1mRNA的3’UTR結合增加PP-1活性，使其去磷酸化。

Potus等[13]通過研究證明miR-126在由肺動脈高壓(PAH)所致的右心室衰竭過程中發揮重要作用。miR-126直接靶向作用于血管內皮細胞生長因子信號通路的負向調節子SPRED-1。由于甲基化作用，miR-126在PAH誘導的右心室衰竭病人表達是下調的，同時該研究證明高水平miR-126可改善微血管密度，降低纖維化，提高右心室功能。

4.3 miRNA與心肌梗死 心肌梗死是所有冠狀動脈疾病的一個重要標志，具有極高的致死率。心肌梗死模型及細胞中，miRNA存在差異表達。有研究發現，miR-1在正常心肌細胞幾乎不表達，心肌梗死病人心臟組織及心肌梗死大鼠模型梗死周邊區miR-1表達明顯上調，miR-1通過抑制抗凋亡因子Bcl-2表達促進心肌細胞凋亡[20-21]。心肌梗死時miR-24表達是下調的，miR-24通過抑制促凋亡蛋白Bim翻譯降低細胞凋亡[2]。

Xu等[22]研究指出，心肌梗死大鼠模型miR-145表達下調，通過慢病毒介導的miR-145過表達，極大地增強心功能，減少梗死面積，阻止梗死后誘導的心肌細胞凋亡。miR-145可能通過與其靶標凋亡相關蛋白4-抗體(PPCD4)結合降低線粒體介導凋亡，從而發揮心臟保護作用。

4.4 miRNA與心室重構 心肌與心肌梗死相關的缺血/再灌注損傷常導致心室重構，此過程受各種miRNA調控。miR-21通過沉默TGF-β受體Ⅲ的基因表達，升高TGF-β1含量，從而激活TGF-β1/Smads通路相關蛋白及基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表達量，促進成纖維細胞分化，并分泌大量膠原纖維，參與心室重構進程[23]。miR-21可直接上調心肌成纖維細胞Bcl-2蛋白表達，從而抑制心肌成纖維細胞凋亡，促進心肌纖維化。特異性miR-21抑制劑可阻止上述反應，避免心肌肥大及纖維化[24]。

分子水平上，成熟的α-MHC轉變為胚胎的β-MHC，導致包括心肌肥大、纖維化等心室重構過程的發生，其中α-MHC內含子中的miR-208a與上述過程有關。miR-208a在心臟中特異表達，通過作用于靶基因甲狀腺激素受體相關蛋白1(THRAP1)發揮作用[5，24]，其敲除能保護心臟免受壓力條件下的病理學重構。將miR-208a抑制劑靶向轉移至高血壓小鼠中，可延遲其誘導的心功能損害，說明miR-208a抑制劑可作為心血管疾病的潛在治療藥物[25]。

4.5 miRNA與心律失常 心律失常即心臟活動的起源和(或)傳導障礙導致心臟搏動的頻率和(或)節律異常，是心血管疾病重要的一組疾病。連接蛋白43(conexin43，Cx43)是由GJA1基因編碼的具有心室細胞間傳導功能的心肌縫隙連接作用(IK1通道)；Kir2.1通道是由KCNJ2基因編碼的，具有調節和維持心臟細胞膜電位功能的通道[26]。缺血性心肌病miR-1表達升高，miR-1通過抑制GJA1和KCNJ2表達而使Cx43和Kir2.1產物減少，從而導致心律失常發生。

HCN2和HCN4屬于超極化激活的循環核苷酸門控通道(HCN)基因家族，它們控制心臟起搏電流(If)，與心臟自律性密切相關。心肌肥厚和心力衰竭病人HCN2和HCN4表達量明顯增高，易導致心律失常的發生。HCN2和HCN4分別受miR-1和miR-133的靶向抑制調節，Luo等[27]通過研究發現，miR-1和miR-133表達下調導致HCN2和HCN4過表達，從而導致肥厚性心肌病電重構的發生。因此，miRNA通過對靶基因調節影響心臟自律性，進而發揮抗心律失常作用。

5 小 結

miRNA的發現改變了對基因表達調控的常規理解。隨著對miRNA了解的深入，如何將其更好地運用于臨床診斷與治療尤為重要。miRNA已廣泛應用于腫瘤的臨床診斷與治療領域，如某種腫瘤miRNA的特異性變化視為信號標志物，為腫瘤進展及病人存活時間等提供依據。心血管系統中，miRNA通過調控細胞分化、遷移和增殖等影響心血管發育和各種心血管疾病等病理生理過程。相關實驗報道，miRNA對動物模型及人體毒性微乎其微，因此在疾病治療方面發揮巨大的潛力。

采用miRNA治療疾病通常有兩種途徑，一種是抑制體內異常表達的miRNA，從而使機體某些生理功能恢復正常；另一種是通過miRNA過表達，沉默體內異常表達基因，保護機體的相應功能免受損害。已有部分基于miRNA合成的藥物達到臨床研究階段，如用于治療丙型肝炎(HCV)的miR-122抑制劑已進入二期臨床研究階段[28]。miR-122在肝細胞特有而且是HCV復制的必需物，miR-122抑制劑的使用可降低病毒復制數量，緩解HCV病程[29-30]。然而，利用miRNA在不同心血管疾病的差異表達設計的藥物目前尚未用于臨床治療中。心血管疾病是一種致死性疾病，發展新的治療和診斷方法很有必要，而miRNA在心血管生物學及心血管疾病中的獨特作用使其成為極具前景的研究靶向。