Duchenne型肌營養不良癥基因突變檢測及家系調查

謝軍 劉剛 王思宇 嚴蕾 楊超 呂蓉 劉小琦

(1 四川省人民醫院皮膚病研究所激光中心 四川 成都 610000)

(2 四川省人民醫院疾病基因研究四川省重點實驗室 四川 成都 610000)

假性肥大型進行性肌營養不良癥(Duchennemusculardystrophy，DMD)是源于橫紋肌的一種連鎖隱性致死性遺傳病，進行性肌萎縮和腓腸肌無力伴小腿腓腸肌假性肥大是其典型的臨床特征，在活產男嬰中的發病率為1/3500～1/4000[1]。發病早、病情嚴重，嚴重影響患兒生活質量，給社會和家庭帶來沉重心理和經濟壓力。本病由抗肌萎縮蛋白（dystrophin，Dys）基因突變引起，Dys由X染色體短臂Xp21基因編碼，分布于骨骼肌和心肌細胞膜的質膜面，起細胞支架作用，維持肌纖維完整性和抗牽拉功能。Dys是肌纖維膜細胞骨架的主要成分，與肌纖維膜蛋白緊密聯合為抗肌萎縮蛋白聯合蛋白，這些蛋白與細胞的層粘蛋白連接，Dys減少引起肌無力可能與這些聯結失調有關[2-4]。由于基因變異引起的Dys缺乏是進行性肌營養不良的主要病因。現有1例臨床診斷為假肥大型肌營養不良的患者，其舅舅已因本病去世，其母親、大姨媽、表姐均可能為缺陷基因攜帶者。對患者完善相關實驗室檢查并明確診斷后，對其家屬作相關基因檢測，了解其基因突變類型后查閱有關文獻，與目前結果相比對，明確其是否存在目前尚且未知的基因突變類型。現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院收治的1例DMD患兒，以進行性肌無力以及運動功能倒退為主訴，均經詳細詢問病史與體檢，且聯合實驗室檢查結果確診為DMD。男性患兒，年齡為9歲，父母雙親非近親結婚。診斷標準：（1）兒童期隱匿性發病，主要包括如下臨床表現：近側肌無力以及肌肉萎縮，有腓腸肌的假性肥大和/或廣泛肌萎縮等；（2）經實驗室檢查，血清磷酸肌酸激酶水平是正常水平的10倍～數百倍；肌電圖呈現出典型性肌病表現，周圍神經傳導速度保持正常水平；（3）除外多發性肌炎和脊肌萎縮癥、重癥肌無力等其他肌肉疾病。患兒及其家屬均對本研究方案知情，且自愿簽署知情同意書，且均經我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集患兒EDTA抗凝外周血2.0ml，應用血液DNA提取盒（由天根生化科技有限公司生產），采用離心柱法將基因組DNA進行提取，然后血樣置于-20℃的冰箱中進行保存、待測。DNA總量＞50μL，質量濃度在100～150ng/μL范圍之內，采用分光光度儀對其進行測定分析，吸光度在1.8～2.0范圍之內。

1.2.2 多重鏈接探針依賴擴增技術（MLPA）的檢測方法 試劑盒均購自于荷蘭MRC-Holland公司生產的P035型試劑盒。嚴格按照試劑盒上的說明進行操作，基因組DNA變性之后，與SALSA MLPA探針之間進行雜交反應，雜交時間在16小時以上，然后將其中加入連接緩沖液與連接酶，進行連接反應，經PCR擴增之后，采用ABI-3130型基因分析儀進行毛細管電泳試驗，得到的數據運用Gene Marker v1.6軟件進行分析處理。

1.2.3 全基因組新一代測序技術（NGS）檢測方法 根據德國生產的QIAamp血液提取試劑盒上的說明書將基因組DNA進行提取，取3.0μL DNA經美國Covaris公司生產的Covaris S2超聲打碎隨機地分解為長度為250-3000bp的片段，且純化，對經過純化的DNA采用T4連接酶以及T4堿性磷酸酶、Klenow片段進行末端修復，且于片段3’端加A堿基，然后通過接頭連接形成標準化的Solexa測序文庫。

1.2.4 Sanger測序 對NGS檢測所發現的點位突變按照具體的突變點位，采用Primer primer 5.0型對引物進行設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，采用PCR技術擴增引物，擴增產物使用測序試劑盒Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Applied Biosystems）測序，最后經過ABI PRISM 3130型基因分析儀進行檢測分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS20.0軟件對本研究中的數據進行處理、分析。

2.結果

經檢測分析，發現受檢者 DMD 基因 4-7 號外顯子缺失變異；發現受檢者母親及二姐 DMD 基因 4-7 號外顯子雜合缺失變異；未發現受檢者姐姐 DM在大片段變異；未發現受檢者三姐 DMD 基因存在大片段變異。

3.討論

Duchenne型肌營養不良的主要臨床特征是進行性肢體肌萎縮肌無力，近端為主，伴小腿腓腸肌假性肥大。一般3～5歲出現癥狀，呈進行性加重，10～12歲喪失行走能力，多于20歲左右死于呼吸衰竭和(或)心力衰竭。研究中的患兒臨床進程基本符合DMD的臨床特點[5-6]，值得注意的是相當部分患兒有運動發育遲滯，但常被家長忽略，而經仔細追問，高達77.8%的患兒均有獨走的延遲。提示臨床醫生，在發現不明原因獨走延遲的男性患兒時應考慮到DMD的可能性[7]。

DMD為X連鎖隱性遺傳性疾病，致病基因為dystrophin,位于染色體Xp21，該基因是目前人類發現的最大的基因，長度約2400～3000kb，約79個外顯子，編碼3685個氨基酸，組成dystrophin蛋白(即抗肌萎縮蛋白)，分子量427KD[8]。Dystrophin蛋白位于骨骼肌和心肌細胞膜內面，為細胞骨架蛋白，具有抗機械牽拉作用，能防止肌細胞在收縮過程中的損傷。Dystrophin與細胞膜內面、跨細胞膜區以及細胞膜外區的多種蛋白如sarcoglycan、dystroglycan等蛋白緊密聯合，相互關聯，在細胞膜內外組成一個整體，維系細胞膜內外的物質交換和聯系，保護細胞膜結構完整和穩定[9-10]。Dystrophin基因缺陷導致肌細胞膜上dystrophin蛋白缺乏或減少，使肌細胞膜不穩定而引起肌細胞壞死和功能喪失。如dystrophin蛋白完全缺乏，則產生DMD表現。

本研究結果顯示：經檢測分析，發現受檢者DMD基因4～7號外顯子缺失變異；發現受檢者母親及二姐DMD基因 4～7號外顯子雜合缺失變異；未發現受檢者三姐DMD基因存在大片段變異。上述結果提示：DMD基因是杜氏/貝氏肌營養不良（DMD/BMD）的致病基因，為X連鎖隱性遺傳方式（XR）；鑒于該類遺傳方式特點（男性攜帶即發病），不對其父樣本進行檢測。在受檢者DMD基因所發現的4～7號外顯子的缺失變異很可能是導致受檢者發病的致病性變異；受檢者其母、其二姐很可能均為致病性變異攜帶者。杜氏肌營養不良（DMD）為DMD基因變異所致的 X 連鎖隱性遺傳病，男性只有1條X染色體，獲得致病基因即發病，發病率為1/3500活產男嬰。女性攜帶缺陷基因時一般不患病，除非由于不幸的萊昂化，導致正常基因所在的X染色體滅活而發病。不過由于還有部分細胞為缺陷基因所在的染色體滅活，正常基因起作用，癥狀要比男性患者輕。DMD病歷中散發病例較多，它可能是[11-12]：①隱匿傳遞的致病基因的“暴露”；②母親卵細胞減數分裂的“差錯”；③母親生殖腺細胞有絲分裂差錯，卵巢中有相當一部分卵母細胞攜帶變異基因，即“生殖腺嵌合”。除減數分裂中發生的差錯再發風險較低外（與一般孕婦相同），隱匿傳遞的再發風險與家族性病例一樣，而生殖腺嵌合的再發風險與變異細胞群的比例有關。由于不能確定變異發生在什么階段，散發病例都要進行產前診斷。有DMD基因變異患兒生育史的母親再次生育時，需進行遺傳咨詢和產前診斷。

綜上所述，通過對Duchenne型肌營養不良癥患者基因突變檢測分析，并對其家系進行調查，可為及時確診DMD提供遺傳學依據。