糖化血紅蛋白的檢測方法及標準化研究進展

王少婷，劉 倩，于 洋，王 艷，曹永彤?

（1.中日友好醫院 檢驗科，北京 100029；2.內蒙古包頭市白云鄂博區婦幼保健院，包頭 014080）

糖基化紅細胞血紅蛋白 （glycated hemoglobin，GHb）是國際上公認的可以反映長期血糖水平的金標準。GHb 由于所結合的成分不同，又分為HbAla （與磷酰葡萄糖結合）、HbAl b（與果糖結合）、HbAlc（與葡萄糖結合）。糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）在糖尿病管理中是公認的血糖控制金標準[1，2]，也是評價糖尿病治療方案的有效指標。目前，世界衛生組織（World Health Organization，WHO） 和許多國家的糖尿病學會已將HbA1c 作為獨立的糖尿病診斷指標[3]。 由于HbA1c 含量最多，臨床上測定的主要是HbAlc[4]。 為避免混淆，國際專家組織建議：GHb 的正規表達為HbA1c，在指南或教育資料中可以使用縮寫A1c 描 述HbA1c[5]。

1 HbA1c 在臨床中的應用

HbA1c 是人體血液中紅細胞內的血紅蛋白與血糖結合的產物，血糖和血紅蛋白的結合生成HbA1c 是不可逆反應，并與血糖濃度成正比，由于紅細胞的生存周期一般為3～4 個月，因此通過觀察HbA1c 水平可用于監測患者過去120d 內總體的血糖控制情況。 且HbA1c 測試不受空腹和胰島素治療的影響。 因此，糖基化紅細胞血紅蛋白是一種控制糖尿病患者病情的很好的測定指標，現在國外已將HbA1c 監測作為糖尿病療效判定和調整治療方案的“金指標”[6]，還是WHO 推薦的糖尿病診斷標準[7]。

2010 年，ADA 對國際專家委員會的建議給予了充分肯定，在其《2010 年糖尿病診療指南》及同期發布的《糖尿病診斷和分布》 中均正式確定將HbA1c 作為糖尿病診斷的一種方法[8]。

GA 是血清白蛋白的非酶糖基化產物，可反映2～3 周的血糖平均水平。 研究表明[9]：糖化白蛋白（glycated albumin，GA） 能客觀的檢測出患者近期血糖的波動情況，具有較好的及時性和準確性，GA 在對2 型糖尿病治療效果判斷上優先于HbA1c。 雖然GA 可以替代HbA1c 評估平均血糖水平，且檢測方便、快捷，但目前在糖尿病隨診中GA控制標準、GA 對糖尿病并發癥的預測價值等領域尚缺乏類似HbA1c 的臨床研究證據，GA 的臨床應用價值和HbA1c 比較仍有差距[10]。

HbA1c 作為評價糖尿病患者長期血糖控制情況及糖尿病并發癥的重要指標，它的檢測方法和試劑廠家繁多，各醫院實驗室操作人員水平參差不齊，導致實驗室之間檢測結果偏倚較大。 現將HbA1c 的主要檢測方法、國際標準化計劃的進展、 我國HbA1c 參考體系建立的現狀及臨床應用進行闡述。

2 HBA1c 的檢測方法

目前，HbA1c 的測定方法較多，方法不同監測結果可能會有較大的差異，常用的方法有高效液相法、微柱法離子交換層析、免疫法、電泳法、酶法等。 美國臨床化學協會（AACC）HbA1c 標準化分會和IFCC HbA1c 標準化工作組建議，將高效液相法（HPLC）作為檢測HbA1c 的金標準[11]。

2.1 離子交換層析法

其檢測原理是基于GHb 和非GHb 所帶電荷不同進行分離。 應用弱酸性陽離子交換樹脂，在一定低濃度洗脫液和接近中性pH 條件下，HbA1c 末端纈氨酸糖基化后幾乎不帶正電荷，首先被洗脫。 非糖基化的HbA 帶正電荷，被高濃度洗脫液洗脫。因此可通過此方法將其與其他組分區分開[12]。此方法血液樣本可用EDTA 和肝磷脂處理[13]。常用的離子交換層析法主要有高效液相色譜法 （HPLC），低效液相色譜法（LPLC）和手工微柱法。 其中高效液相色譜法具有分離效率高、抗干擾能力強的特點，能夠降低血紅蛋白變異體對HbA1c 檢測結果的干擾。HPLC 法對全血直接測定HbA1c 其批內和批間變異系數CV 均可以<1%（CV<1%），結果精確。 此方法測定HbA1c 具有操作簡單，快速，準確的特點，對于長期保存的標本依然具有很好的穩定性[14]。此方法曾應用于美國DCCT 的研究，是目前檢測HbA1c 的金標準。 但環境溫度、 緩沖液的離子強度和pH對測定結果影響較大。此方法最大的缺點是實驗所用儀器及試劑、耗材昂貴，難以在基層醫院推廣普及[15]。

2.2 電泳法

電泳法的原理是基于膠體顆粒在一定條件下帶有不同電荷，帶有電荷的膠體顆粒可以借靜電吸引力在電場中泳動。血紅蛋白結構不同，所帶的電荷情況也不同，在瓊脂糖凝膠上的電泳遷移速度也不同，血紅蛋白經瓊脂糖電泳后，距離陰極端最近的是含糖基最少的HbAl 和HbAlb，處于中間部分的是HbA1c，距離陽極端最近的是Hb 的主要成分HbA0。 通過光密度儀掃描計算，最終得HbAlc 的百分含量。 該方法樣本用量少，分辨率高，重復性較好。 可發現異常Hb，異常Hb 的存在可使HbA1c 假性增高[16]，但電泳法速度比較慢，自動化程度低，急診插入、自動維護等功能比較欠缺，無法進行實時檢測，目前尚無商品化、具有批量樣本通過能力的儀器面世，因此該法現已少用于臨床，主要用于HbA1c 研究。

2.3 免疫法

免疫法的原理是以血紅蛋白β 鏈N 末端最初的4-8個氨基酸殘基作為抗體識別位點，制備相應的單克隆抗體，HbA1c 與相應的單克隆抗體結合發生凝集。 其測定方法相對成熟，結果準確性好。

2.3.1 離子捕獲法

其原理是GHb 與相應抗體結合后，聯結熒光標記物，形成反應復合物，再聯結帶負電荷的多聚陰離子復合物，而在IMX 反應孔中的玻璃纖維預先包被了高分子的四胺合物，使纖維表面帶正電，前述的反應復合物吸附在纖維表面，經過一列清洗后測定其熒光強度，從而得到GHb 的濃度，該方法靈敏度和特異性高，重復性好，自動化程度高，回收率可達98.85%，交叉污染率低于0.01%，適用于成批GHb 樣本的檢測[17]。但是該方法受樣本濃度影響，高濃度樣本檢測結果偏低，這與抗體濃度不能達到相關高度有關，需要稀釋；還有HbS、HbC、HbE 和HbF 等變異血紅蛋白可影響檢測結果。

2.3.2 免疫凝集法

是一種利用HbA1c 與相應的單抗結合進而發生凝集反應，通過測定吸光度直接測定總Hb 中HbA1c 百分含量的方法。 該方法不用購置專門的儀器，可在全自動生化分析儀上進行測定，因而節約了實驗室成本，適合于成批的樣本檢測。但該方法易受脂肪血、黃疸等樣本因素影響，抗交叉污染較差，而且要求血紅蛋白在一定范圍之間才能達到較好的線性。

2.3.3 化學發光法

采用離子捕捉免疫分析法，應用抗原抗體反應原理，聯以熒光標記物。 通過連接帶負電的多陰離子復合物，吸附到帶正電的纖維表面。 經過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強度變化率計算濃度。該法檢測系統易于規范和重復，可減少操作技術誤差，檢測的靈敏度和特異度高，批內、批間變異系數小，回收率和準確度高，交叉污染率小，影響因素少，但由于需采購專用試劑包和免疫發光分析儀成本昂貴，因此僅適用于大批量樣本檢查[18]。

2.3.4 酶法

酶法的原理是變性后的血標本經蛋白酶消化，糖基化的纈氨酸釋放出來，作為底物果糖纈氨酸氧化酶（FVO）的氧化產生H2O2，H2O2在辣根過氧化物酶的作用下與特定的色原耦聯[19]。 酶法檢測HbA1c 在低值可檢測范圍比HPLC 法更低，而在高值可檢測范圍也比HPLC 法低。

2.4 床旁檢測（point of care testing，POCT）方法

雖然臨床上使用方便，也成為HbA1c 檢測發展的重要趨勢，但其分析性能（正確度和精密度）普遍不及實驗室檢測儀器，由于HbA1c 個體內生物變異小，并與糖尿病微血管并發癥密切相關，因此測定精密度是評價儀器性能的關鍵指標之一，也是多數POCT 儀器HbA1c 測定結果不能滿足糖尿病診斷和監測要求的主要原因[20]。

3 HbA1c 檢測標準化現狀及進展

HbA1c 作為糖尿病首選的診斷標準，又是糖尿病篩查以及血糖控制的“金標準”，測定結果的準確性直接關系到糖尿病患者的干預和血糖控制不同的檢測原理、測定方法可以得到不同的HbA1c 的測定值，加上變異Hb（HbS、HbC、HbE 和HbF）的影響，使得測定結果的準確性、重復性以及各實驗室之間結果有較大差異，根本談不上可比性。而診斷指標要用于臨床，首先要可比，而解決可比性的關鍵在于量值溯源。因此其測定結果具有溯源性和可比性非常重要。 如何建立一個國際公認的，結果可以互相比對的HbA1c 分析體系越來越受到臨床重視。

3.1 國際標準化進程

HbA1c 的標準化工作可以分為兩個階段：第一個階段是以美國、瑞典、日本為代表的國家、地區標準化，第二個階段是國際臨床化學與醫學實驗室聯盟（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的全球標準化。

為了HbA1c 檢測結果的一致性，早在1984 年Petcrson等就首次提出HbA1c 檢測標準化的問題，并對實驗室間不同檢測方法的相關性和重復性進行了評估。 直到1993年，糖尿病控制與并發癥試驗（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）研究結果發表后，美國臨床化學協會 （American Association for C1inical Chemistry，AACC）建議所有HbA1c 檢測結果的單位應與DCCT 單位一致，進而催生了美國HbA1c 標準化計劃 （National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP），于1996 年完成。NGSP 參考系統是以DCCT 數值為基礎，把NGSP 參考實驗室網絡中各種實驗方法都校準為DCCT 參考方法，并建議各實驗室只能采用被NGSP 認可的方法來檢測HbA1c使臨床實驗室的檢測結果與DCCT 的檢測結果更具有相關性，大大減少了各實驗室之間的差異。

國際上有3 個HbA1c 國家標準化項目：美國的國家HbA1c 標準化計劃（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP），日本糖尿病學會與日本臨床化學協會的聯合計劃 （Japanese Diabetes Society/Japanese Society for Clinical Chemistry，JDS/JSCC 以 及 瑞 典 的Mono-S in Sweden 計劃[21]。 其中最為“著名”的是NGSP。

國際臨床化學與檢驗醫學聯合會（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）在1995 年成立了HbA1c 標準化工作組，旨在建立國際公認的檢測HbA1c 參考方法和參考物質，并于2002 年正式發表了HbA1c 的參考測定體系，同時制備HbA1c 和HbA0 的純物質參考物質，實現了計量學上向國際單位制SI 溯源。 隨后又統一了HbA1c 的命名和單位。 至此，經歷了各國的標準化及全球標準化兩個不可分割的階段，最終實現了HbA1c 測定的全球可比性。

2003 年，美國99%的實驗室HbA1c 檢測結果都能溯源到DCCT，ADA 在糖尿病診療指南中推薦HbA1c 作為監測血糖控制的“金標準”正是基于此結果[22]。 2007 年，美國糖尿病組織、歐洲糖尿病研究學會、國際糖尿病聯盟和IFCC 等學術組織在意大利舉辦了首次HbA1c 檢測標準化共識會議，發表了“HbA1c 檢測全球化聯合聲明”，確定了IFCC 的參考系統是唯一能夠滿足標準化要求的方法，并由此衍生出NGSP 單位（%）。 2010 年．再次發表聯合聲明：HbA1c 檢測必須在世界范圍內標準化，包括參照系統和數值報告。

IFCC HbA1c 標準化工作組還組建了參考實驗室網絡，截至2014 年10 月底，該網絡已包括16 個獲認證的參考實驗室和3 個候選實驗室，每個實驗室運行1～2 種IFCC 參考方法。

3.2 中國HbA1c 標準化的現狀及局限

盡管國際上HbA1c 檢測標準化工作已經進行了很多年并達成了共識，但是由于HbA1c 檢測受多種因素影響，我國HbA1c 測定標準化工作仍然處于起步階段，在精密度和準確性方面與發達國家相比仍存在較大的差距，一般CV 仍在7%～10%[23]，與5%的國際標準存在較大差距，這無疑阻礙了HbA1c 作為診斷指標應用于臨床。

在2011 年之前，由于沒有國家標準，國內開展HbA1c實驗室檢測現狀很不理想，各實驗室采用的HbA1c 檢測系統很多，甚至很多實驗室仍在采用非標準化的方法，缺乏相關的參考實驗室網絡及正確性驗證的途徑，結果可比性不容樂觀。 2011 年1 月，由復旦大學附屬中山醫院潘柏申教授牽頭，與上海交通大學附屬瑞金醫院內分泌代謝病研究所和上海交通大學附屬第六人民醫院糖尿病研究所3 家具有NGSP 資質的實驗室共同組織了上海地區HbA1c一致性計劃。 這項工作為中國HbA1c 標準化工作提供了寶貴經驗。

目前在中國，絕大部分醫院均開展了HbA1c 檢測項目，多種檢測方法在中國均有使用，但不同方法之間的一致性不理想，某些HbA1c 試劑沒有成熟的標準化認證，只能取各醫療機構檢測結果的平均值作為標準進行評價，但納入的實驗室數量嚴重影響評價標準。 但我國對HbA1c檢測方法的標準化的重視正在日益提高，HbA1c 參考體系已基本建立。 2011 年6 月國家食品藥品監督管理局組織制定的《HbA1c 分析儀》醫藥行業標準通過專家二審討論。衛生部臨床檢驗中心按照IFCC 參考體系建立了國際公認的HbA1c 一級參考方法，并制備了3 個濃度水平的標準物質，參考測量實驗室認可工作也在進行中。 該標準的發布和實施結束了我國HbA1c 檢測方法上市不統一，無章可循的狀態。 NCCL 參考方法于2013 年12 月底通過CNAS ISO 17025 校準實驗室的認可。 在2014 年常規HbA，室間質量評價（external quality assessment，EQA）中，我們采用IFCC 參考方法確定指定值，取代了以往采用組內中位數作為指定值的做法。

2017 年，召開項目啟動會、成立全國HbA1c（HbA1c）專業委員會，分別在青海省、四川省、江西省、云南省、寧夏自治區開展省級標準化工作會議；2018 新年伊始省級標準化工作會議在陜西省、廣東省、安徽省陸續拉開，計劃全年在全國持續推進，覆蓋約50 個城市。截止目前已開展的8 個省份成立了“HbA1c 標準化工作組“，為各省HbA1c 標準化工作奠定了堅實基礎，隨著項目在全國各地深入開展，將有更多專家、學者參與其中，將大大加快中國HbA1c標準化工作步伐。

4 展望

從檢驗方法方面來說，所有的檢測方法都不是十分完美，都有著自己的缺點，相信隨著對HbAlc 實驗方法不斷改進，HbAIc 的更多新的檢測方法可以在臨床上廣泛應用，為患者造福。

從標準化角度來講，在我國，整合和開發現有資源，積極開展HbA1c 測定的一致性和標準化工作，因此在HbA1c 標準化的道路上，仍需加快步伐。相信在各方持續、有效的共同努力下，將不斷提高HbA1c 的測定質量，以適應HbA1c 臨床應用發展的需要，更有效地運用HbA1c 以推動糖尿病防治工作的發展，充分發揮其作用。