高效液相色譜法在白酒分析中的應(yīng)用

安明哲，廖勤儉，李楊華，羅 珠

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC）是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。白酒的分析檢測(cè)不僅可以幫助人們認(rèn)識(shí)白酒，在食品安全中也起著至關(guān)重要的作用，比如重金屬、塑化劑等物質(zhì)的含量在酒類(lèi)行業(yè)中有嚴(yán)格的要求，這就要求檢測(cè)手段必須具有很高的精密度。HPLC在白酒中的運(yùn)用時(shí)間長(zhǎng)，方法成熟，已被廣泛運(yùn)用在白酒的醇類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)的檢測(cè)中。本文總結(jié)了近年來(lái)HPLC在白酒中的分析檢測(cè)運(yùn)用，以提供白酒中微量物質(zhì)檢測(cè)手段的參考。

1 HPLC在甜味劑分析中的應(yīng)用

在白酒中加入甜味劑以增加白酒的甜味和回甜感以改善口感，成為了許多不法生產(chǎn)商的潛規(guī)則。廣泛應(yīng)用的人工合成甜味劑主要包括甜蜜素、阿斯巴甜、糖精納等，甜味劑在各種香型的白酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中禁止添加[1-4]。食品行業(yè)中檢測(cè)甜味劑的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和離子色譜法等，最新食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.247—2016規(guī)定了食品中紐甜測(cè)定的高效液相色譜法[5]。其前處理過(guò)程包括混合提取液提取、固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等步驟。

考慮到國(guó)標(biāo)提供的食品中紐甜測(cè)定方法的復(fù)雜性，劉石雪等[6]對(duì)高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量的各個(gè)影響因素進(jìn)行了探究，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。最后采用Agilent C18色譜柱（5μm,150 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為乙腈-離子對(duì)試劑緩沖液，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min測(cè)定白酒中的甜味劑。此方法中，紐甜濃度在0.16～25μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢出限0.06μg/mL，加標(biāo)回收率在93.75%～98.13%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法分離度較好，操作穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，適用于白酒中紐甜的檢測(cè)。馬雪豐等[7]研究建立了同時(shí)測(cè)定白酒中6種甜味劑安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、甜菊糖苷、紐甜、阿力甜的高效液相色譜分析方法。從樣品前處理方法、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相梯度的不同條件的選擇，最終確定以ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）為色譜柱，乙腈-乙酸銨（20 mmol/L）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。6種甜味劑能在25 min內(nèi)完成分離，在5～100μg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)＞0.9999）。該方法的檢出限低，在3個(gè)加標(biāo)水平下，樣品平均回收率在87.0%～103.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜3%。該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，可用于白酒中6種甜味劑的同時(shí)測(cè)定。

優(yōu)化白酒中甜味劑高效液相色譜的檢測(cè)方法，可以為精確測(cè)定微量甜味劑提供可靠有效的檢測(cè)保障。

2 HPLC在酸類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用

酸類(lèi)化合物是酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，白酒中的有機(jī)酸對(duì)酒的性質(zhì)有著較大的影響，其種類(lèi)和數(shù)量決定著白酒的品質(zhì)和口感。酸量少，酒味淡，后味短；酸量大，酸味露頭，酒味粗糙。適量的酸可對(duì)酒起緩沖作用，并在貯存過(guò)程中能緩慢地形成酯。酸對(duì)酒的甜度也有影響，太酸的酒使酒的“回甜”減弱。優(yōu)質(zhì)白酒的酸含量較高，一般高于普通白酒1～2倍。因此，酸的含量適中對(duì)于白酒的質(zhì)量起著舉足輕重的作用，對(duì)酸類(lèi)化合物的準(zhǔn)確定性和定量也成為白酒行業(yè)中重要的課題。白酒中酸類(lèi)物質(zhì)的分析方法主要有氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法、高效液相色譜法等。

劉露等[8]利用高效液相色譜法分析白酒中的琥珀酸，色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm×1.7μm）；流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4，pH2.3，用0.22μm濾膜過(guò)濾；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫箱30℃；流動(dòng)相流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果顯示，保留時(shí)間為2.1 min，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999，精密度為1.17%，加標(biāo)回收率在89.0%～101.8%之間，滿(mǎn)足分析方法要求，優(yōu)化后的方法樣品前處理方式簡(jiǎn)單，分析樣品時(shí)間短，便捷高效，能夠較好地對(duì)白酒中琥珀酸定性定量分析。方毅菲[9]首次利用高效液相色譜分析豉香型白酒中的二元酸，采用的方法是DM-2大孔吸附樹(shù)脂或等效大孔吸附樹(shù)脂提純、Ultimate AQ-C18色譜柱、梯度洗脫、紫外檢測(cè)器進(jìn)行二元酸的液相色譜分析和外標(biāo)法定量等技術(shù)的結(jié)合，結(jié)果顯示，二元酸的線性范圍為0～80 mg/L，R＞0.999，RSD＜3%，樣品回收率為100%±5%。余劍霞[10]利用高效液相色譜法測(cè)定豉香型白酒中微量的高級(jí)脂肪酸，測(cè)得亞麻酸、肉豆蔻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.84%、0.42%、0.42%、0.77%、0.22%和3.07%，回收率為91.4%～105.5%，線性范圍為0～50 mg/L，r≥0.99954。王芳等[11]建立了利用高效液相色譜儀同時(shí)檢測(cè)乳酸、乙酸、丁酸、己酸的方法；馮向東[12]建立了高效液相色譜法測(cè)定白酒中乳酸和乙酸含量的方法；李斌等[13]建立了高效液相色譜法測(cè)定濃香型白酒中乳酸含量的方法；張寶玉[14]建立了高效液相色譜法測(cè)定酒醅中乳酸含量的方法；魏志陽(yáng)等[15]對(duì)高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定清香類(lèi)酒醅中主要酸類(lèi)物質(zhì)的方法進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、流速及酒醅中主要酸類(lèi)物質(zhì)提取條件（乙醇濃度、提取時(shí)間）的優(yōu)化，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定酒醅中乳酸和乙酸的方法。莊俊鈺等[16]采用活性炭(ZS-207)凈化法前處理白酒樣品測(cè)定了豉香型白酒中的乳酸含量，此方法簡(jiǎn)單易操作，凈化效果好。

酸類(lèi)物質(zhì)是白酒中最重要的微量物質(zhì)成分之一，精確地分析其成分可以為控制白酒質(zhì)量提供依據(jù)。

3 HPLC在酯類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用

白酒原糧中含有大量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)水解后生成氨基酸，經(jīng)過(guò)發(fā)酵或者糖化作用生成大量的醇類(lèi)化合物，醇類(lèi)化合物與有機(jī)酸在酯化反應(yīng)的作用下合成多種酯類(lèi)化合物，使白酒具有獨(dú)特的香味[17]。

徐靜[18]利用五糧液成品酒作為樣本，選擇固相微萃取作為前處理方法，采用直接進(jìn)樣法，建立了乳酸乙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯的液相色譜分析方法，該方法流動(dòng)相體系簡(jiǎn)單，無(wú)需前處理，方便快捷，通過(guò)與氣相色譜方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，建立的高效液相色譜法準(zhǔn)確、靈敏、快速。張房宇[19]建立了反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定米香型白酒中乳酸乙酯、乙酸乙酯的方法，酒樣無(wú)需任何處理直接入樣。相關(guān)系數(shù)分別為r=0.99986和r=0.99979；樣品濃度采用外標(biāo)法測(cè)定，回收率分別為98.5%～101.9%和98.1%～101.7%；最低檢出質(zhì)量濃度分別為0.34 mg/L和0.44 mg/L；該法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。魏志陽(yáng)等[15]通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、流速及酒醅中主要酯類(lèi)物質(zhì)提取條件（乙醇濃度、提取時(shí)間）的優(yōu)化，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定酒醅中乳酸乙酯和乙酸乙酯的方法。王群等[20]建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定芝麻香型白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯四大酯類(lèi)的方法，酒樣不需要繁瑣的處理，經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后即可直接進(jìn)樣。

4 HPLC在吡嗪類(lèi)化合物分析中的應(yīng)用

吡嗪類(lèi)化合物是一類(lèi)含1，4-二氮雜苯母環(huán)化合物的總稱(chēng)，廣泛存在于自然和發(fā)酵食品中，具有類(lèi)似于炒堅(jiān)果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對(duì)其他香味有顯著的烘托和疊加作用。四甲基吡嗪（又稱(chēng)TTMP）是一種重要的吡嗪化合物，其測(cè)定方法有氣相色譜法，液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

司冠儒等[21]利用HPLC快速檢測(cè)芝麻香型白酒中TTMP，以甲醇∶水（v/v）=35∶65作為流動(dòng)相，選用phenomenex Gemini C18柱，在278 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。結(jié)果表明，樣品回收率為94.67%～100.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.29%～1.77%。此方法操作簡(jiǎn)便，具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。司冠儒等[22]對(duì)比了氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)芝麻香型白酒中TTMP的方法，并對(duì)3種方法檢測(cè)TTMP的回收率和精密度進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，3種方法的回收率和精密度都滿(mǎn)足檢測(cè)的要求。但液相色譜法的優(yōu)勢(shì)明顯，TTMP響應(yīng)較高，出峰前后沒(méi)有其他風(fēng)味物質(zhì)的干擾，且樣品無(wú)需前處理直接進(jìn)樣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)人員的素質(zhì)要求較低，便于推廣。

5 HPLC在有害物質(zhì)分析中的應(yīng)用

5.1 HPLC在塑化劑分析中的應(yīng)用

隨著白酒行業(yè)中“塑化劑事件”的曝光，人們開(kāi)始關(guān)注白酒塑化劑的安全問(wèn)題。塑化劑（增塑劑）是指鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)（phthalicacid esters,PAEs），是一種高分子材料助劑，被廣泛應(yīng)用于食品接觸材料中。塑化劑揮發(fā)性低，穩(wěn)定性高，易溶于有機(jī)溶劑，屬干擾生物體內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)[23]，對(duì)人體極其有害。白酒中塑化劑的來(lái)源包括原料中、生產(chǎn)加工過(guò)程中的塑料容器、運(yùn)輸、存儲(chǔ)過(guò)程中的各個(gè)因素和非法添加等[24]。蔡英翔等[25]利用HPLC色譜分析法法測(cè)定白酒中的6種鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)，檢出限低，加標(biāo)回收率好。郭麗萍等[26]采用高效液相色譜大體積進(jìn)樣法測(cè)定白酒中7種鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)，方法簡(jiǎn)便，效果好。曹江平[27]建立了利用分散液液微萃取-高效液相色譜法測(cè)定白酒中的酞酸酯含量的方法。

5.2 HPLC在氨基甲酸乙酯分析中的應(yīng)用

氨基甲酸乙酯（EC）又名尿烷，是一種產(chǎn)生于發(fā)酵食品和飲料酒中的化合物，主要是在發(fā)酵、蒸餾和貯存時(shí)形成。20世紀(jì)初期，EC曾用于麻醉劑，到20世紀(jì)40年代，研究者發(fā)現(xiàn)EC具有致癌性。1974年，世界衛(wèi)生組織（WHO）的國(guó)際癌癥研究所（IARC）把EC定為2B類(lèi)致癌物，隨后又于2007年3月將其由2B類(lèi)致癌物提升為2A類(lèi)致癌物，即對(duì)動(dòng)物有致癌作用，對(duì)人類(lèi)可能有致癌作用[28]。

肖美蘭等[28]采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)特香型白酒中氨基甲酸乙酯（EC）的含量，研究了不同發(fā)酵周期生產(chǎn)的基酒中EC的含量。

6 結(jié)論

高效液相色譜作為白酒分析中常用的一種儀器設(shè)備，除能夠準(zhǔn)確地分析白酒中的甜味劑、酸類(lèi)、酯類(lèi)和塑化劑外，還可以分析白酒中其他物質(zhì)。尋思穎等[29]利用酚類(lèi)物質(zhì)的熒光特性和手性拆分劑β-環(huán)糊精拆分重疊峰，建立帶熒光檢測(cè)-高效液相色譜儀法測(cè)定醬香型白酒中10種揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)含量的方法。陳清艷等[30]通過(guò)對(duì)白酒中酪醇的高效液相色譜分析方法中檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相進(jìn)行研究，建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法。王春利等[31]建立了白酒中8種生物胺殘留的高效液相色譜分析方法。白酒中的微量物質(zhì)眾多，各種類(lèi)型的微量物質(zhì)組成了不同香型白酒的獨(dú)特風(fēng)味。建立準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)方法，對(duì)于提高白酒產(chǎn)品質(zhì)量、保障白酒安全、協(xié)助政府加強(qiáng)酒類(lèi)市場(chǎng)監(jiān)管方面具有重要意義。