云杉屬樹種體胚發生研究進展

李青梅，高 芳，韓 姣，孫 悅，趙吉勝, 陳士剛

（1.吉林省林業科學研究院，吉林 長春 130033；2.長白山森工集團敦化林業有限公司，吉林 敦化 133700）

云杉屬樹種具有適應性強、抗逆速生等優點，是園林綠化與用材的重要樹種。云杉屬樹種傳統的繁殖方法為種子繁殖和扦插繁殖，種子繁殖存在繁殖周期長，優良遺傳基因退化以及遺傳性狀不穩定的現象，且云杉屬樹種生長緩慢，一般要4～5年才能獲得可移栽的苗木。而扦插繁殖存在繁殖系數與成活率低等問題。在云杉屬樹種的育種工作中，利用體胚發生技術與傳統的繁殖技術相結合，能夠較好的解決這些問題。

體細胞胚胎發生是指雙倍體或單倍體的體細胞（非合子細胞）在特定條件下，未經性細胞融合而通過與合子胚胎發生類似的途徑發育出新個體的形態發育過程。具有遺傳穩定、繁殖快、數量多、結構完整等優點，并且具有以低成本繁育出大量高品質苗木的潛能。體胚發生技術在云杉屬樹種應用較為廣泛，該技術為云杉屬樹種的品種改良和規模化繁殖提供較為理想的技術平臺，本文綜述了云杉屬樹種體胚發生的現狀、影響因素及當前存在的問題，以便為云杉屬樹種建立高效的體胚發生體系提供借鑒。

1 云杉屬樹種體胚發生的研究現狀

云杉屬樹種全世界約40種，我國云杉屬樹種資源豐富，有16種9變種。1985年Hakman等首次報道了挪威云杉體胚發生并獲得再生植株，使云杉屬樹種體胚發生體系有了質的飛躍。經過近30年的研究，白云杉、黑云杉、紅云杉、歐洲云杉、庫頁云杉、西加云杉、恩氏云杉、塞爾維亞云杉等云杉屬樹種的體細胞胚胎發生技術已有報道。從20世紀80年代以來，國內相繼對原產我國的云杉屬樹種的體細胞胚胎發生進行了研究，其中，青杄、白杄、紅皮云杉、沙地云杉、麗江云杉的體細胞胚胎發生究已有報道；其中挪威云杉、白云杉、黑云杉體胚發生獲得了較為深入的研究，并且已經大規模的應用于造林實踐中，帶來了巨大的生態和經濟效益。目前，挪威云杉作為云杉屬樹種的模式植物已經開展了從細胞學水平到分子水平的全面探索，特別是全基因組測序圖譜的完成，對于闡明云杉屬樹種體細胞胚胎發生及其調控機制將發揮巨大作用。

2 體細胞胚胎發生過程

植物體胚發生方式可分為兩種，即直接體胚發生和間接體胚發生。直接體胚發生即從外植體上直接誘導出體細胞胚，間接體胚發生即需要經過胚性愈傷組織誘導階段，就目前對國內外云杉屬樹種的研究，屬于間接體胚發生，其發育階段分別為：愈傷組織誘導；愈傷組織保持與增殖；體細胞胚的發育與成熟；體細胞胚的萌發與植株再生；再生植株的移栽。

3 云杉屬體細胞胚胎發生過程影響因素

3.1 愈傷組織誘導過程中的影響因素

外植體對愈傷組織誘導的影響：根據細胞全能性理論，植物任何細胞、組織、器官在適宜條件下，都有發育出完整新個體的可能，對許多樹種的研究表明，以未成熟胚為外植體較成熟胚具有更大的潛能。在云杉屬樹種中以未成熟合子胚成功實現體胚發生的居多。外植體的生理狀態也是極為重要的，因為外植體會隨著生長季節而逐漸喪失胚胎發生的能力，在培養過程中，應采集胚胎發生較強生理狀態的外植體。同時外植體的基因型對云杉屬樹種體胚發生影響較大，不同無性系外植體的同一采集時期和同一無性系的不同采集時期均會對試驗效果產生巨大的影響。

培養基對愈傷組織誘導的影響：基本培養基的成分和狀態對體細胞胚胎發生至關重要。云杉屬樹種體胚發生培養基較多，包括mLV、1/2mLV、LM、MS、1/2MS、改良P6培養基等。培養基的選擇影響體胚發生的培養效果，不適宜的培養基會導致誘導效果差甚至會導致試驗的失敗。在培養基中氮素的形態對體胚發生起著重要的作用，通常在含有較高濃度的NH4NO3的培養基對體胚發生不利，明顯降低NH4+和NO3-的濃度有利于提高體胚發生率。在植物組織培養中，培養基中是鉀離子對體胚發生是必須的，鉀離子是維持陰陽離子平衡的主要離子。在低氮素條件下，不適當的鉀離子濃度的影響特別明顯。

植物生長調節物質對愈傷組織誘導的影響：研究表明，影響體細胞分化的因素很多，但其中最重要的是植物生長調節物質。生長素是研究體胚發生最多的植物生長調節物質，在不少植物中已經證明是胚胎發生所必需的。2，4-D和NAA是針葉樹種體胚發生較常用的植物生長調節物質。細胞分裂素在云杉屬樹種中也起到很重要的作用，常用的細胞分裂素有KT、TDZ和6-BA。其中6-BA作為常見。生長素和細胞分裂素的種類與濃度對云杉屬樹種體胚發生具有重要的影響，二者的濃度過高或過低或比例不當聚會對試驗效果產生重要的影響。因此在試驗過程中，應該妥善處理植物生長調節物質的種類與濃度，以便達到更好的效果。

環境因子對愈傷組織誘導的影響：環境因子對體胚發生的影響也較大，環境因子、培養溫度、培養容器和培養狀態均會對體胚發生的效果產生重要的影響。國內外云杉屬樹種體胚發生過程中，一般采用暗培養的研究方法。云杉屬樹種的體胚發生可以采用液體或固體的培養方法，但以固體培養基居多。

3.2 愈傷組織增殖過程中的影響因素

云杉屬樹種胚性愈傷組織的保持與增殖一般在生長素與細胞分裂素的共同參與下進行，生長素以2，4-D和NAA最為常見，細胞分裂素是以6-BA最為常見。在此過程中，一般要降低植物生長調節物質的濃度，繼代周期以2周左右為宜，既能保持胚性愈傷組織的胚性，又能獲得較大的增殖量。

3.3 體胚發育與成熟過程中的影響因素

體胚發育與成熟階段一般在提高了滲透壓的培養環境下進行，在云杉屬樹種中選用PEG4000居多，脫落酸（ABA）是一種天然的植物生長調節劑，ABA對體胚發生，尤其是對體胚成熟特別重要。研究表明ABA能夠抑制胚的過早萌發對云杉屬樹種體胚成熟具有重要的影響，國內外成功實現體胚發生的云杉屬樹種均在培養基中加入了ABA，A B A的主要作用是促進體胚成熟，減少畸形胚的產生，抑制體細胞胚的過早萌發，防止針葉樹種的裂生多胚現象。在云杉的研究中發現ABA能夠促進體細胞胚的脂類和蛋白體的積累，因而促進體胚的成熟。

3.4 體胚的萌發與植株再生過程中的影響因素

體胚萌發即成熟的體細胞胚在適宜條件下發育成新的植株，包括成熟體胚的生根以及胚軸和子葉的伸長。云杉屬樹種體胚萌發與植株再生過程一般以WPM和MS為基本培養基，在此過程中一般降低蔗糖的濃度，撤除植物生長調節物質，添加低濃度的活性炭以提高植株再生率。關于體胚的萌發狀況，不同的植株之間存在很大的差異。因此，在體胚萌發過程中，選取發育優良的植株使很有必要的。

4 展望

體胚發生是一個復雜的過程，包括一系列的生理生化反應和復雜的器官發生反應，同時影響體細胞胚胎發生的因素很多，從而給體胚發生技術的研究帶來了巨大的困難。在今后的研究中，需要在現有研究的基礎上進一步深化研究，要利用現代分子生物學技術分離與胚性發育相關的基因，進一步揭示云杉屬體細胞胚胎發生分子機理及其調控機制，建立更多高效穩定的體細胞胚胎發生和植株再生體系。這些研究將為云杉屬樹種種質資源的保護提供理論依據，為體細胞胚胎發生在林業生產中的實際應用作出貢獻。