淺談如何提高“蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)”實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性

鄧祥宜，程占云，方雨婷

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205）

0 引言

酶是生物化學(xué)的重要內(nèi)容。其中，酶的酶學(xué)性質(zhì)及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。開(kāi)設(shè)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)有利于學(xué)生在實(shí)際操作中充分理解相關(guān)知識(shí)、掌握實(shí)驗(yàn)技巧。學(xué)校生物工程、食品科學(xué)與工程、食品質(zhì)量與安全專業(yè)的“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”課程開(kāi)設(shè)了綜合性較強(qiáng)的“蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)”實(shí)驗(yàn)。教學(xué)中，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性欠佳，不少小組間測(cè)定結(jié)果偏差較大；通過(guò)多年教學(xué)，結(jié)合每次實(shí)驗(yàn)的情況，筆者分析總結(jié)，對(duì)如何上好該實(shí)驗(yàn)有了一些體會(huì)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵控制點(diǎn)也可為其他酶學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)和科研工作提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容簡(jiǎn)介

學(xué)校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)使用內(nèi)部編寫(xiě)的教材，“蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)”實(shí)驗(yàn)要求從酵母粉中提取蔗糖酶，催化底物蔗糖水解，通過(guò)3,5-二硝基水楊酸（DNS）法檢測(cè)產(chǎn)物還原糖的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)速度。通過(guò)比較不同溫度、不同pH值下的酶促反應(yīng)速度，確定酵母蔗糖酶的最適溫度、最適pH值；在最適溫度、最適pH值條件下，通過(guò)測(cè)定不同底物濃度下的酶促反應(yīng)速度，繪制雙倒數(shù)曲線（Lineweaver-Burk曲線），從而求得蔗糖酶的Km值，以及該酶量對(duì)應(yīng)的Vmax。

2 教學(xué)的主要目標(biāo)及問(wèn)題

實(shí)驗(yàn)的教學(xué)目標(biāo)是讓學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象充分認(rèn)識(shí)溫度、pH值、底物濃度對(duì)酶活力的影響，掌握測(cè)定酶最適溫度和最適pH值的方法，以及酶促動(dòng)力學(xué)測(cè)定Vmax和Km的方法。但是在上課過(guò)程中，常常出現(xiàn)小組間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相同，最適溫度、最適pH值、Km的測(cè)定偏離明顯，而且蔗糖酶的最適溫度受開(kāi)課時(shí)氣溫高低影響明顯。如何讓所有小組的結(jié)果趨近于一致，使不同小組的學(xué)生都能準(zhǔn)確地測(cè)定出相關(guān)指標(biāo)，是擺在教師面前的緊迫問(wèn)題。

3 問(wèn)題的解決

科學(xué)實(shí)驗(yàn)必須經(jīng)得起反復(fù)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)不僅要某個(gè)人自己能重復(fù)做出來(lái)，還要不同的人能重復(fù)做出來(lái)。實(shí)驗(yàn)在大二上學(xué)期開(kāi)設(shè)，學(xué)生專業(yè)技能是有限的，不經(jīng)過(guò)上課時(shí)的專門(mén)強(qiáng)調(diào)和有針對(duì)性的指導(dǎo)，往往達(dá)不到預(yù)期目標(biāo)。筆者經(jīng)過(guò)多年教學(xué)的觀察和分析，找出了實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵控制點(diǎn)，從而提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，讓學(xué)生更容易獲得成功的喜悅、建立學(xué)習(xí)的自信。

3.1 關(guān)于酶液的制備和稀釋

為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的綜合性和模擬真實(shí)的研究，實(shí)驗(yàn)中要求每個(gè)小組從酵母粉中提取蔗糖酶用于該實(shí)驗(yàn)，由于每個(gè)小組提取液中的蔗糖酶濃度存在差異，導(dǎo)致顯色后吸光度偏離有效范圍的情況時(shí)有發(fā)生，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法按時(shí)完成。因此，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)課前，由教師通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定酵母蔗糖酶提取的較好條件：酵母粉添加量（每批酵母粉蔗糖酶活力存在差異，且受存放時(shí)間影響）、加水量、研磨時(shí)間、稀釋倍數(shù)等。實(shí)驗(yàn)中，要求各組將提取的蔗糖酶交給教師混勻（消除各組提取的蔗糖酶濃度差異，讓全班使用相同濃度的酶），再分發(fā)給各組單獨(dú)進(jìn)行梯度稀釋，摸索獲得合適的稀釋倍數(shù)，經(jīng)教師匯總相關(guān)結(jié)果后，全班確定統(tǒng)一稀釋倍數(shù)用于該實(shí)驗(yàn)的研究，從而避免了各組酶濃度、稀釋倍數(shù)差異可能造成的混亂，保證實(shí)驗(yàn)均能按時(shí)完成。

3.2 酶促反應(yīng)pH梯度的設(shè)置

按照原先的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，酶促反應(yīng)考查pH值3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，教學(xué)過(guò)程中，一些小組測(cè)定的最適pH值為4.0，也有一些為5.0，經(jīng)常會(huì)有學(xué)生問(wèn)到底最適pH值為多少，哪個(gè)是對(duì)的，面對(duì)這個(gè)問(wèn)題，筆者讓學(xué)生通過(guò)課外興趣實(shí)驗(yàn)測(cè)得蔗糖酶的最適pH值在4.5～4.6（一些實(shí)驗(yàn)教材中蔗糖酶酶活測(cè)定使用pH值4.6[1]），于是將實(shí)驗(yàn)的pH值梯度調(diào)整為2.6，3.6，4.6，5.6，6.6，7.6，由于pH值4.6處的酶促反應(yīng)速度顯著高于其他值，使得所有小組測(cè)定的最適pH值均為4.6，避免了先前pH值4.0，5.0處的酶促反應(yīng)速度比較接近、難以判斷的問(wèn)題。

3.3 關(guān)于酶促反應(yīng)體系的準(zhǔn)確量取與混勻

由于該實(shí)驗(yàn)要測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物的多少，屬于定量實(shí)驗(yàn)，所以反應(yīng)體系各成分的準(zhǔn)確量取是基礎(chǔ)，所有學(xué)生對(duì)于這一點(diǎn)的認(rèn)識(shí)很到位。但在“混勻”這個(gè)環(huán)節(jié)，少數(shù)學(xué)生會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，造成測(cè)定值存在偏差。實(shí)驗(yàn)步驟中描述為“混勻”，在操作過(guò)程中，酶促反應(yīng)體系小，其混勻一般比較容易，但是在“還原糖與DNS反應(yīng)結(jié)束后，用水定容至15 mL”這一步，少數(shù)學(xué)生做完“混勻”操作后，刻度試管中上層液體與下層液體顏色不一致（上層液體往往偏淺），如果此時(shí)測(cè)定吸光度，取上層液體或者下層液體都不能代表該管的真實(shí)吸光度，所以實(shí)驗(yàn)中要跟學(xué)生再三強(qiáng)調(diào)“混勻混勻，不光是混，還要混到‘勻’為止”經(jīng)過(guò)反復(fù)強(qiáng)調(diào)，并且讓學(xué)生在測(cè)定吸光度前拿給教師檢查，解決了“混勻”這一問(wèn)題。

3.4 關(guān)于反應(yīng)時(shí)間和溫度的科學(xué)控制

由于是定量實(shí)驗(yàn)，在反應(yīng)時(shí)間的控制上必須精確，如“還原糖與DNS混勻后于沸水浴中反應(yīng)5 min”，“酶促反應(yīng)于37℃水浴鍋中反應(yīng)10 min”等。教師給學(xué)生強(qiáng)調(diào)的是，計(jì)時(shí)務(wù)必“精確到秒”。實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生在沸水浴中DNS顯色、水浴鍋中酶促反應(yīng)的時(shí)間控制要格外小心和準(zhǔn)確。還原糖測(cè)定一般很準(zhǔn)確，葡萄糖標(biāo)曲的R2一般都大于0.995，但不少學(xué)生酶促反應(yīng)的結(jié)果卻可能很糟糕。原來(lái)學(xué)生對(duì)“精確計(jì)時(shí)到秒”的理解僅僅是水浴鍋中酶促反應(yīng)的時(shí)間，而忽略了加完酶后，在室溫下酶促反應(yīng)已在進(jìn)行，也忽略了酶促反應(yīng)結(jié)束后從水浴鍋中取出試管至加入DNS之前，酶促反應(yīng)也在繼續(xù)進(jìn)行。因此，在教學(xué)中，酶促反應(yīng)的精確計(jì)時(shí)除了強(qiáng)調(diào)“精確計(jì)時(shí)到秒”，還要強(qiáng)調(diào)“嚴(yán)格控制和盡量避免規(guī)定溫度外的反應(yīng)時(shí)間”。具體操作時(shí)，讓學(xué)生將酶液與反應(yīng)其他成分分別預(yù)熱，在混勻的一瞬間開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后立即取出并加入DNS終止反應(yīng)。這樣，由于反應(yīng)時(shí)間的嚴(yán)格控制和預(yù)熱操作的執(zhí)行，所有小組酶的最適溫度都為37℃，雙倒數(shù)曲線的相關(guān)系數(shù)也達(dá)到了0.99左右。

4 結(jié)語(yǔ)

相比理論課的教學(xué)，學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)課具有更大的興趣，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性影響著學(xué)生的學(xué)習(xí)自信，進(jìn)而與后來(lái)的學(xué)習(xí)態(tài)度密切相關(guān)。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)是本科教學(xué)中較難的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性不太好。筆者在教學(xué)實(shí)踐中找到了酶液制備與稀釋、pH值梯度設(shè)置、體系混勻、反應(yīng)時(shí)間及溫度的科學(xué)控制等4個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)，提高了該實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重現(xiàn)性。以往部分學(xué)生因?qū)嶒?yàn)結(jié)果不理想而感覺(jué)受挫，進(jìn)而使其學(xué)習(xí)積極性和學(xué)習(xí)自信的情況得到了很好的解決。

對(duì)筆者而言，教師不僅是一份職業(yè)，更是被當(dāng)作事業(yè)。在多年的“生物化學(xué)”教學(xué)工作中，觀察、學(xué)習(xí)、思考、總結(jié)從未停止，因而在教學(xué)中有了一些改進(jìn)和感悟[2-3]。在將來(lái)的工作中，將再接再厲，因?yàn)椤敖處熞o學(xué)生一碗水，自己要有一桶水”，而“教師要永遠(yuǎn)裝滿一桶水，必須要有一眼泉”[3]。