生殖道沙眼衣原體分子流行病學研究進展

劉蘭蘭 李武 孫思 張莉 張濤 呂純芳 陳忠偉 羅珍冑 陳祥生

1深圳市南山區慢性病防治院皮膚性病防治科518000；2深圳市南山區慢性病防治院檢驗科518000；3中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所 中國疾病預防控制中心 性病控制中心，南京210042

在許多國家，生殖道沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）感染的病例數已超過淋球菌感染，占性病之首。Ct可感染各年齡人群，但主要集中于15～29歲的性活躍人群［1］。Ct感染泌尿生殖道后，約50%的男性和70%（亦有研究顯示80%）的女性無癥狀，或臨床癥狀隱匿，為Ct的防控帶來很大的挑戰［2］。盡管很多國家開展Ct防治項目（涉及免費篩查、檢測，治療、咨詢，性伴通知等），投入大量人力、物力、財力，但收效甚微，Ct發病率仍持續上升。菌株變異、致病機制及傳播動力學等有關Ct分子流行病學方面的研究，對于Ct的防治至關重要。

一、分子流行病學

（一）病原學特征：Ct是一類嚴格胞內寄生、菌體大小介于細菌和病毒之間、可通過細菌濾器的原核細胞型微生物。Ct基因組全長1 042 kb（是大腸桿菌基因長度的1/4），還包含一個隱匿性質粒，基因長度7.5 kb［3］。Ct的主要外膜蛋白（MOMP）由ompA基因編碼，該基因長度1.2 kb，由4個可變區1～4和5個保守區組成。可變區基因片段的長度為40～100 bp，其中可變區2是高度變異區，這些可變區穿插在保守區中間。根據可變區序列氨基酸序列的不同，可將Ct分為19種血清型（A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、Ga、H、I、Ia、J和K型，以及L1、L2、L2a和L3）［4］。

（二）分子流行病學技術：宏觀橫斷面流行病學研究可分析Ct在時間、地區及人群中的分布，若了解Ct血清型別的分布、識別基因序列的變異與進化、傳播動力學、鑒別治療失敗與再感染等的微觀信息，則需通過分子流行病學的方法進行分析。分子流行病學方法主要包括限制性片段長度多態性（RFLP）和ompA基因測序分型等（表1）。

1.RFLP：是基于ompA基因的PCR-RFLP分析而對Ct菌株進行分型的一種方法，其原理是首先用特定的引物擴增ompA基因，然后用限制性內切酶對PCR擴增的ompA基因產物進行酶切。酶切的順序為：先用內切酶AluⅠ進行酶切，然后用其他內切酶（HinfⅠ、EcoRⅠ、DdeⅠ、CfoⅠ或BstUⅠ）進行酶切，根據酶切片段的長度不同，通過凝膠電泳對Ct菌株進行分型。研究發現，該方法與血型分型結果的一致率達95.0%［5］。PCR-RFLP既不需要對Ct菌株進行細胞培養，也不需要對Ct的單克隆抗體進行純化，且操作簡單，耗時短，因而得到較廣泛的應用。然而，RFLP也有局限性，若多種型別同時感染或重組菌株感染，酶切之后，則會產生非典型性、模糊不清的片段。對于這些非典型性條帶，需反復酶切鑒定，工作繁重且耗時。此外，RFLP是單位點分型方法，分辨率低，加之ompA基因具有一定程度的變異，因此，RFLP不能鑒別單個核酸的變化。

2.ompA基因測序分型：與其他分型方法相比，ompA基因測序分型具有較高的分辨率，可發現Ct序列中微小的變異，是目前研究Ct分子流行病學的主要方法。隨著技術的改進，在ompA基因測序分型的技術上，衍生出兩種方法，包括多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和多位點可變數目串聯重復序列分析（multilocus variable number tandem repeats analysis，MLVA），這兩種方法可識別種群的遺傳結構，發現物種的多樣性及評估基因型別與疾病之間的關系。

MLST是基于對5個Ct管家基因（hctB、CT058、CT144、CT172、pbpB）進行巢式擴增，然后測序分析，從而對菌株的等位基因進行多樣性比較分析。研究發現，與ompA基因分型相比，MLST具有較高的鑒別能力。Klint等［6］用MLST和ompA基因分型方法對47個臨床分離的菌株進行分型，結果顯示，MLST可發現32種變異型菌株，ompA基因分型僅發現12種變異型菌株。MLVA是基于分析Ct基因組ompA和不同位點可變數量串聯重復序列的特征，然后采用聚類分析對Ct進行分型。MLVA分型能更準確揭示Ct聚集特征、菌株起源與變異等流行病學信息。同樣，與MLST類似，MLVA的分辨率亦高于ompA分型法。

3.雜交法：雖然MLST及MLVA的分辨率較高，但不能區分混合感染菌株的型別，而雜交法可區分混合感染。目前雜交法有3種，反向線性雜交技術（reverse line blot hybridization）、反向點雜交技術（reverse dot blot hybridization）和微球懸浮芯片雜交技術（microsphere suspension array hybridization）。反向線性雜交技術是將擴增的基因產物與已標記探針的尼龍膜雜交，再與化學發光檢測試劑發生反應，反應結束后，會在膜上出現斑點，通過對雜交斑點分析，可進行分型，并可鑒別混合感染，其主要缺點是耗時（1.5 d）。有學者用反向線性雜交技術對Ct進行分型，發現Ct混合感染率為8%～25%［7］。反向點雜交技術與反向線性雜交技術類似，相較于后者，其操作簡單且耗時短，不需要特殊機器，結果肉眼可讀，還可根據待測標本的數量準備雜交膜的數量，且標本的排放順序比較靈活。微球懸浮芯片雜交技術也是基于雜交技術，但與反向點雜交技術和反向線性雜交技術相比，不需將探針或DNA產物固定在膜上。該方法操作簡單，耗時短且結果易理解，對多重感染具有較高的鑒別能力。雜交技術的主要缺點是分辨率低于ompA分型，且依賴于固定的探針，對于變異的菌株很難鑒別。

4.DNA芯片技術：也稱為DNA微陣列，是一種多位點分型DNA（multilocus typing DNA）芯片技術，多位點的選取與MLST的靶區域相同。與MLST相比，多位點分型DNA避免過度測序，快速（96個標本可同時檢測）且靈敏度高。研究顯示，多位點分型DNA的分辨率是ompA測序的2.4倍，且特異度高達100.0%［8］。多位點分型DNA結果的分析可在1 d內完成，耗時遠低于MLST（3～4 d），且數據分析及分型可直接在多位點分型系統中分析。此外，多位點分型DNA設備及耗材的費用較DNA測序低。

5.全基因組測序：由于不同Ct菌株型別之間會發生大量重組，采用ompA測序研究這種重組菌株，其結果并不可靠。全基因組測序可深入了解Ct的進化、變異、多樣性及流行狀況。全基因組測序需依靠細胞培養，以提供足量Ct DNA，而細胞培養的陽性率較低且培養周期長，使其過程變得繁瑣，限制了在臨床的廣泛應用。近年來，隨著免細胞培養技術的引入，可直接從臨床標本中提取足量DNA進行全基因組測序。其中一種免細胞培養技術是將MOMP結合抗體附著于磁珠，以從臨床標本中分離富集Ct感染的細胞［8］。對于一些商業標本采集管，由于管中的裂解緩沖液會破壞MOMP的結構，因此無法使用該方法。盡管全基因組測序可更全面、更深入的了解Ct，但費用昂貴，且需要技術精湛的專業人員及特殊設備。

二、分子流行病學技術的應用

1.開展分子流行病學調查與檢測：全球Ct主要的流行型別為E（30.0%）和F（12.9%），是比較保守的型別，而高度變異的型別是L2和G［9］。Rodriguez等［10］發現，E型不但是主要的流行型別，而且非常穩定，地域間的差異較小。研究表明，大部分感染者是由少數血清型引起，型別在不同人群中的分布存在一定差異。在社區、不孕不育、性病門診及學生人群中，主要流行型別均是E型，次要流行型別則多種多樣。女性性工作者的主要流行型別在不同的研究中不同，如泰國女性性工作者的主要流行型別是F，中國和韓國是E型，匈牙利則是D型。然而，男男性行為者（MSM）人群中常見的流行型別是G、D及J，且D型在無癥狀MSM的尿道和肛周陽性率較高［11］。若在一個地區發現了新型別，則可能是由于本地人與其他地區的人發生性行為，進而引進新的血清型別。

2.開展臨床分子流行病學研究：不同的Ct型別可引起不同臨床癥狀［12］。其中A、B、Ba及C型常見于熱帶和亞熱帶地區，主要引起沙眼，經眼-眼或眼-手-眼傳播，嚴重者可影響視力甚至致盲［13］。研究發現，泌尿生殖道標本中亦可檢出A型和B型Ct，說明引起沙眼的菌株與引起生殖道感染的菌株之間可能存在重組，導致兩組型別之間有交叉感染［14］；C～K型主要引起泌尿生殖道感染［15］；有過孕史的女性較易感染D型［16］。E型感染多無癥狀，易被感染者忽略，這也是E型是優勢菌株的原因，但也有研究報道，E型與異位妊娠及陰道綠色分泌物有關［16-17］。此外，相較于其他型別，感染F/G型的女性較易出現下腹疼痛，但疼痛程度較其他型別引起的下腹疼痛輕［18］。

有報道，E型可引起新生兒結膜炎［14］；L1～L3型通過性接觸傳播，引起性病性淋巴肉芽腫（LGV）亞種［19］。LGV主要分布于MSM人群，但有研究顯示，L2感染與女性盆腔炎有關［16］。

3.鑒別持續感染、再感染與治療失敗：持續感染與治療失敗為Ct的防治帶來挑戰。研究顯示，Ct復發感染在性活躍人群中較常見。2002年，一項Meta分析表明，阿奇霉素1 g單劑口服和多西環素對Ct感染的治愈率分別是97%和98%［20］。另有研究顯示，1 g單劑口服阿奇霉素對生殖道沙眼衣原體的治愈率為71.6%，明顯低于前者的治愈率［21］。復發的原因究竟是治療期間的性行為導致的再次感染，還是治療失敗引起，仍然需通過對Ct菌株型別的分型進行鑒定。

4.協助LGV的臨床診斷：近年來，LGV在歐洲、非洲、東南亞及北美等國家的報告病例數逐漸上升［22］。LGV具有較強的侵襲性，在MSM人群的肛門-直腸拭子標本中檢出率較高，這與其組織嗜性及宿主特殊的性行為有關［8］。荷蘭學者在MSM人群中發現新型LGV，將其命名為L2b［23］。隨后，奧地利學者也是在MSM Ct陽性者中發現，MOMP的VS1、VS2及VS4區域發生變異的新型別，并將其命名為L2c、L2d及L2e［24］。肛門直腸的LGV感染癥狀常隱匿或無癥狀，易被患者忽視，且較難與其他Ct感染型別區分［8］，因此，有必要在MSM人群中開展Ct篩查，并對陽性標本進行分型，以鑒別感染型別及發現LGV新型別。

5.發現變異菌株：2006年，在瑞典發現新型變異菌株（new variantChlamydia trachomatis，nwCT）。之所以將其稱為nwCT，是由于該菌株的隱蔽性質粒缺失了377 bp長度的基因片段。當時核酸檢測技術的目標引物恰好包含此缺失片段，因此漏檢了nwCT，使其迅速在人群中擴散傳播。研究顯示，nwCT菌株是E型，且多分布于性活躍的年輕人群中［25］。nwCT在其他國家里亦有發現，如墨西哥、丹麥及法國等［26］。目前，盡管在我國尚未發現nwCT，但仍有必要用分子流行病學技術對類似的變異進行監測，以及時采取防控措施。

三、結語

Ct發病率高、流行范圍廣、危害嚴重，引起全球公共衛生高度關注。為降低Ct感染的疾病負擔，推廣Ct感染篩查及分子流行病學分析，采取針對性防治措施顯得愈加重要。分子流行病學方法可闡明Ct的臨床癥狀譜，發現變異菌株，識別優勢菌株，評估傳播動力學，探究菌株型別在不同人群間的分布，鑒別持續感染與新發感染等。這些分子流行病學信息可用于Ct篩查及優化臨床治療方案等，進而為Ct的防治提供分子生物學方面的依據。

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