細胞自噬與缺氧缺血性腦損傷的研究進展

黃 林 魯利群

成都醫學院第一附屬醫院兒科，四川成都 610500

新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）是指各類圍生期窒息引起部分或完全缺氧、腦血流減少或中斷而導致的胎兒或新生兒腦損傷。各類缺氧缺血性事件（胎盤早剝、子宮破裂、臍帶脫垂等）是HIE 的主要原因，HIE可導致新生兒殘疾和死亡，活產足月兒全球內發病率約為1.5/1000，幸存者中25%～30%留有不同程度智力障礙、癲癇等并發癥，約20%患兒在新生兒期死亡［1-2］。隨著新生兒重癥監護技術提高，HIE 存活率有所提高，但患病率仍無明顯降低。因此，明確新生兒HIE 的發病機制，探索防治HIE 新方向十分重要。一直以來，細胞自噬被認為是調節細胞穩態的保護性機制，然而研究表明，它在成人缺血性腦卒中中發揮著雙重作用［3］。那么自噬在新生兒HIE 中發揮什么作用呢？本文就自噬的生物特性及其在缺氧缺血性腦損傷發生、發展中的兩面性進行文獻綜述。

1 細胞自噬

1.1 自噬的定義

自噬意為“自己吞噬自己”，這一現象是比利時生物醫學家de Duve 于1963 年首次描述，自噬廣泛存在于酵母、哺乳類動物等真核生物中，在進化上高度保守［4］。它是高度依賴溶酶體的降解與再循環途徑。衰老或錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器被膜結構隔離包裹，運至溶酶體，降解并產生氨基酸、核苷酸、脂肪酸等可利用的物質。自噬是維持機體自身穩態的重要方式。

1.2 自噬的分類及過程

自噬主要分為三大類型：微自噬、巨自噬、分子伴侶介導的自噬，巨自噬最常見，也是通常所說的“自噬”，主要過程分為誘導自噬、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及內容物降解。去磷酸化的Atg13 與ULK、Atg101 及FIP200 結合，形成前起始復合物，自噬激活［5］。Beclin-1 通過VPS34-p150 復合體與UVRAG、Atg9、Atg14 等蛋白結合，形成Ⅲ型PI3K 復合物啟動自噬，該復合物的中心蛋白是Beclin-1，凋亡相關蛋白Bcl-2 可結合到Beclin-1 上，抑制起始復合物的形成［6］。ULK1 激酶復合物磷酸化Beclin-1 時，Beclin-1 促進PI3K 復合物轉變為PtdIns3P，召募Atg8/LC3、Atg7 和Atg5-Atg12-Atg16L1 等相關蛋白到PAS，使自噬囊泡膜延伸和自噬體成熟［7］。最終，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體。其中，LC3-Ⅰ通過Atg3 和Atg7 與PE連接酯化為LC3-Ⅱ，生成的LC3-PE 共軛物是自噬體膜的必要物質［8］，因而，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ常作為自噬標志蛋白。自噬體膜受體蛋白SQSTM1/p62，最終被降解，因此p62 是自噬流標志。

2 腦缺氧缺血后誘發細胞自噬

當機體遭遇饑餓或缺氧缺血等，能量耗竭AMPK被激活，抑制TSC1/TSC2，降低mTORC1 活性，Atg13去磷酸化增強形成前始復合物激活自噬［9-10］。PI3K/Akt是mTORC1 上游信號通路。生理情況，Beclin-1 使PI3K 激活、Akt 磷酸化、mTORCl 激活，從而抑制自噬；腦缺氧缺血后，活化過氧化物酶體增殖物活化受體γ，抑制Beclin-l 進而負性調控mTORCl 活性，增強自噬［11］。此外，Zhang 等［12］發現缺血/再灌注大鼠腦組織中，NF-κB/p53 信號通路參與自噬和凋亡。缺血缺氧時NF-κB 進入胞核，p62 表達增強，抑制p53、Bcl-2表達，LC3-Ⅱ和Beclin-l 表達顯著，激活自噬［13］。低氧誘導因子（HIF）1 是缺氧狀態下重要轉錄調控因子，缺氧時HIF-1α 高表達促進Bcl-2/BNIP3 復合物生成，Beclin-1 大量游離，激活自噬［14］。總之，缺氧缺血時，機體有幾條不完全獨立的自噬激活途徑，如AMPK-mTORC1、PI3K/Akt-mTOR、NF-κB 及HIF-1α信號通路等。

3 缺氧缺血性腦損傷與細胞自噬

長期以來，自噬被認為是細胞的一種適應性保護機制，在缺氧缺血、氧化應激等病理情況下，回收再利用廢物以制造能量及代謝的基本物質。Su 等［15］首次將自噬抑制劑應用于新生幼鼠缺氧缺血模型，觀察到抑制自噬后缺氧缺血后的細胞迅速壞死，提出自噬是一種潛在而普遍的保護機制。但在某些情況下，自噬會導致細胞死亡［16］，一類是自噬誘導細胞死亡或凋亡，另一類是自噬性死亡（Ⅱ型程序性死亡），但它在形態學上獨立于凋亡或壞死的死亡途徑［15］。

3.1 腦缺氧缺血后自噬的保護作用

在缺氧缺血的大腦損傷過程中，自噬活性對細胞存活十分重要。研究發現［17］，3 日齡新生SD 大鼠腦缺氧缺血后，模型組Beclin-1 表達增加，且與神經元修復的時間窗一致，而Caspase-3 表達趨勢則相反，推測自噬參與神經元修復，減輕腦損傷。然而這種保護作用能被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）所阻斷［18］。如果在腦缺氧缺血前先低氧預處理，發現通過Rab7誘導神經元自噬體成熟及自噬通量恢復，海馬CA1 區自噬體明顯增加，腦梗死明顯減少，而用氯喹抑制自噬體融合后，其產生的保護作用被抵消［19］。另有研究表明［20］，在大鼠腦卒中模型中，缺血預處理提前激活神經元自噬，可顯著減輕細胞凋亡。因此，提前激活自噬可在腦缺氧缺血后發揮保護作用。Sheng 等［21］實驗發現，大腦中動脈結扎前，腦室內預注射雷帕霉素或3-MA，前者激活自噬，腦梗死體積、腦水腫、運動障礙減輕，3-MA 組LC3、Beclin-1 表達下降，抑制自噬，腦損傷加重。以上均證明自噬預激活自噬在腦損傷中發揮保護作用。皮質神經元細胞氧糖剝奪（OGD）的48 h，Dai 等［22］用慢病毒轉染Sirt3 高表達后，OGD 模型損傷減輕，AMPK 磷酸化水平增加，證實Sirt3 主要通過活化AMPK-mTOR 信號通路增強自噬起保護作用。但該研究局限性在于僅在細胞水平上進行研究，還需要更多的體內實驗驗證。新生10 d SD 大鼠缺氧缺血的24 h，用氯喹抑制自噬后，腦損傷加重，活性氧（ROS）含量增多，線粒體超氧化物降低，推斷自噬抑制介導細胞凋亡加重與缺氧缺血大鼠線粒體功能障礙有關［23］。以上推測，在缺氧缺血不同階段，激活自噬會產生不同效果，而在發揮保護作用階段的具體機制暫不明確，需進一步研究。最近研究推測［24］，適度自噬促進細胞存活，而過度自噬加劇細胞死亡。在腦卒中體內外模型中均得到驗證，同型半胱氨酸通過抑制PI3KAkt-mTOR 信號通路，導致過度自噬，加重對神經干細胞的毒性［25］。OGD/復氧48 h 以后，3-MA 抑制自噬，神經細胞存活增加。缺氧缺血的晚期階段，自噬過度激活，自噬扮演損傷的角色。

3.2 腦缺氧缺血后自噬的損傷作用

研究認為，自噬加重缺氧缺血后腦損傷。Descloux 等［26］建立新生小鼠腦損傷模型和神經興奮毒素鵝膏蕈氨酸培養原代皮質神經元，24 h 后檢測到神經元自噬增強，預注射3-MA 不僅抑制自噬，還抑制Caspase-3 的活性，腦損傷明顯減輕。體外實驗也得到同樣結果。提示重度新生兒腦損傷時，抑制自噬可能是潛在的有效策略。同樣，七氟醚后處理HIE 大鼠，發現通過ERK 級聯抑制大腦過度自噬，減輕腦損傷［27］。所以，自噬可能是缺氧缺血后潛在治療靶點。雖然自噬與凋亡、壞死在形態學上和分子機制上不同，但在缺氧缺血腦損傷時交叉。它們有共同的分子介質，如AMPK、Bcl-2、p62 等［28］。缺血神經元中，Wnuk 等［29］發現凋亡和自噬均存在，靶向調控自噬后，抗凋亡信號增加，細胞損傷減輕。因此，這兩個過程可能存在拮抗或協同。在新生兒HIE 中觀察到多種形態的細胞死亡，但在海馬CA3 區常見的是形態特征上異于凋亡和壞死的自噬性死亡，而強心苷類藥物（Na+/K+-ATPase抑制劑）抑制自噬，減輕自噬性死亡的發生［30］。自噬介導的死亡和自噬性死亡在形態學上容易區分，而互相之間的機制卻仍待探索。

自噬性死亡主要通過溶酶體途徑發生，在HIE模型中，缺氧缺血可以誘導大量自噬小體產生，24 h 時海馬區Beclin-1 和LC3 顯著增加，3-MA 抑制自噬后可明顯減輕海馬損傷［31］。提示自噬可能促進缺氧缺血后腦損傷。但可能是自噬清除不足，也稱呼自噬流受損，用氯喹抑制溶酶體后，自噬蛋白LC3 增加，自噬體增加，損傷減輕［32］。另外發現［33］，焦亡與自噬也有聯系，慢病毒轉染下調NLRP3 炎癥小體后，Beclin-1、Agt7 水平下降，而抗自噬蛋白升高，表明其主要是通過抑制自噬發揮保護作用。因此，無論體內外模型，缺氧缺血后自噬是明顯增強的。激活自噬大部分發揮著加重損傷的作用。但這與自噬程度、發生階段、外界因素等相關。并且，自噬會引起自噬性死亡，并和凋亡、焦亡及內質網應激等相互作用，加重組織損傷。

4 小結

自噬調節蛋白功能和體內平衡相當重要。許多體內外實驗證據表明，自噬具有兩面性。自噬預激活或在缺氧缺血后早期和適度激活時，可以減輕腦損傷，發揮保護作用，而重度缺氧缺血或過度激活時，自噬會和/或其他死亡方式一起，表現負性作用。自噬在HIE 中的角色可能由自噬程度、自噬發生時間以及自噬流受損等因素決定，而如何調節自噬相關特性以減輕缺氧缺血后神經元損傷需進一步探索。此外，自噬抑制劑如3-MA、巴佛洛霉素、氯喹等特異性較低，基于這些藥物的實驗結果有待驗證。自噬相關基因可能發揮與自噬無關的生物功能，因此特異性敲除自噬相關基因得出的結果也是有限的。高度特異性的試劑、更好動物模型的開發有助于研究人員深入理解自噬在疾病中的確切作用。