黃芪多糖在水產動物疾病防控中的應用

李春靜，張 杰，祝雅晨，孔祥會

( 河南師范大學 水產學院，河南 新鄉 453007 )

隨著水產養殖技術的提高，集約化養殖規模逐漸擴大，水產養殖種類不斷增多，養殖水環境也進一步惡化，發病率的明顯升高給水產養殖業造成巨大經濟損失。目前，在水產養殖中激素、抗生素、化學合成藥物等應用普遍。但由于漁藥的不合理使用，尤其是抗生素類藥物的濫用，導致病原微生物產生耐藥性，養殖魚類免疫力降低和環境受到污染；此外，藥物殘留使水產品的品質下降。因此，研發和應用低毒、高效、低殘留的中草藥是水產動物疾病防控的重要選擇[1]。

天然中草藥具有獨特的抗微生物和寄生蟲的抗菌驅蟲作用，無有害殘留及不易使水產品產生耐藥性等，毒副作用小。中草藥免疫活性物質主要分為多糖、苷類、生物堿、有機酸、揮發性油等[2]。研究表明，將一些中草藥單獨或按比例混合使用可以促進魚體生長發育；降低飼料系數，提高營養物質的利用率[3]；改善腸道菌群的組成[4]，增強機體免疫力[5]。但是，中草藥成分復雜，直接使用并不能確定單一的有效成分，科研人員轉而研究中草藥的活性成分，探討中草藥主效成分及其作用機理。

黃芪(Astragalusmembranaceus)作為一種促生長和提高水產品品質的水產飼料添加劑，其作用及相關機理逐漸被人們揭示，但仍有許多方面值得深入研究。研究證明，在飼料中添加黃芪多糖(APS)可不同程度地提高動物超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、溶菌酶等酶活力[6-7]，且其活性與給藥劑量呈正相關；黃芪多糖可以提高動物的抗病能力[8-9]，但是對動物免疫的增強作用與黃芪多糖添加水平之間并非線性關系；黃芪多糖能抑制維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)引起的鯽魚(Carassiusauratus)細胞凋亡[10]。這些研究結果從個體以及細胞層面證明了黃芪多糖可以提高動物的特異性和非特異免疫及抗病性。筆者總結近年來黃芪多糖在水產動物抗病中的研究應用效果，以作為今后開展黃芪多糖研究和防病應用的理論依據。

1 黃芪多糖

1.1 黃芪多糖的特征

黃芪毒副作用小，價格低，不易產生抗藥性，作為一種補益中草藥添加劑迄今已應用逾2000年。1943年多糖作為藥物開始使用，1981年黃芪多糖首次被提取分離，其分子式為C10H7ClN2O2S[11]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，是黃芪干燥的根經提取、濃縮和純化而成的水溶性多糖，具有抗病毒、抗疲勞、抗衰老、抗菌等功能[12-14]，能綜合性地提高機體免疫力，促進抗體產生，延長抗體作用時間，并能誘生干擾素，起到抗病毒的作用[15]。

多糖化學結構是其生物活性的物質基礎，單糖的組成對多糖活性的影響遠遠小于糖苷鍵和單糖連接方式[16]。研究發現，組成黃芪多糖的單糖為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖；在構成黃芪多糖的單糖中，甘露糖是主要成分，其次是葡萄糖[17]。黃芪多糖包括3個亞型: APSⅠ、APSⅡ和APSⅢ。APSⅠ為由D-葡萄糖、D-半乳糖及L-阿拉伯糖構成的雜多糖，其平均相對分子質量為36.3 ku；APSⅡ和APSⅢ均為葡聚糖，多以α-(1→4) 鍵連接，少數以α-(1→6) 鍵鏈接[18]。劉星堦等[19]從膜莢黃芪中獲得黃芪多糖，由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1∶0.95∶0.70。鄒一愚等[20]采用乙醇沉淀法將分級得到兩組分APSⅠ和APSⅡ，兩者之比為0.31∶0.69；APSⅡ中葡萄糖含量明顯低于APSⅠ，且APSⅠ中不含半乳糖和阿拉伯糖，但木糖含量很高。說明黃芪多糖中大分子量部位含有大量戊糖，而小分子量部位則以葡萄糖和半乳糖為主。以上研究證實，黃芪多糖的單糖組成和側鏈結構由于提取的品種和工藝不同差異很大。

1.2 黃芪多糖提取方法

黃芪多糖可通過多種方式從黃芪中提取，主要有水提取法、堿醇提取法、酶解法、超聲波浸提法、微波提取法、組織破碎提取法、超高壓提取法和超濾法。丁利君等[21]分別比較了水浴浸提法、超聲波浸提法和微波浸提法等多種方法提取黃芪多糖的效果，發現水浴浸提法提取率最高。用微波萃取技術從蒙古黃芪干燥根中萃取黃芪多糖[22]，測得的相對分子量為11 ku，純度達97.16%；用紅外光譜、13C核磁共振和1H核磁共振技術確定試驗所得黃芪多糖主鏈由葡萄糖以α-型糖苷鍵連接而成。劉星堦等[19]通過水提法再經柱層析洗脫獲得黃芪多糖，初步純化得粗多糖，再進一步純化得平均分子質量為37.5 ku的白色粉末狀黃芪多糖。目前黃芪多糖的提取主要還是以傳統的水提法和酶解法為主，但有研究表明，將傳統方法與超濾等現代化工藝相結合，可提高黃芪多糖的純度以及提取率。

1.3 黃芪多糖的安全性

黃芪多糖急性和亞慢毒性試驗結束時，小鼠行為及各組織(心臟、肺、肝臟、腎臟)均正常，未發現任何毒副反應[23]，表明黃芪多糖對動物是安全的。吳旋等[24]急性毒性試驗表明，黃芪多糖對金絲魚(Tanichthrsaltbonubes)的96 h 半數致死質量濃度高達2394.89 mg/L，表明較高劑量使用黃芪多糖也是安全的。試驗證明，以推薦劑量(日添加10 mg/kg)、3倍推薦劑量、5倍推薦劑量連續21 d投喂草魚(Ctenopharyngodonidella)，分階段采取試驗草魚全血及血清進行臨床病理學檢測和組織病理切片。結果表明，黃芪多糖喂養的草魚未見細胞及組織上的異常。以推薦劑量投喂黃芪多糖養殖水產動物安全可靠，即使達到5倍的推薦劑量時，也沒有安全性問題[25]。由此可見，黃芪多糖可以作為一種安全、有效的免疫增強劑應用于水產養殖業，并且對人體無毒害。

2 黃芪多糖的抗病作用機理

2.1 黃芪多糖可促進免疫器官的發育

與哺乳動物免疫器官組成不同，魚類沒有骨髓和淋巴結，頭腎為主要的造血器官。魚類免疫器官與組織主要指腎臟、脾臟、胸腺以及消化道淋巴組織與小淋巴細胞等；黏膜淋巴組織也是其免疫系統的重要組成部分[26]。

黃芪多糖能夠促進動物胸腺、骨髓、脾臟的質量增加和發育，而免疫器官的質量和發育會直接影響機體免疫力[27]。林旋等[28]在基礎飼料中添加不同劑量黃芪多糖，結果發現，黃芪多糖可促進魚體免疫器官的發育和成熟，從而提高魚體免疫力；黃芪多糖作用效果隨著添加量的升高而增強。在鯉魚(Cyprinuscarpio)的研究中也有相似的結果，飼料中添加1%的黃芪多糖，能夠明顯提高鯉魚胸腺、頭腎和脾臟的質量，增強鯉魚免疫機能[29]。黃芪多糖能有效增加免疫器官質量，促進部分臟器的發育，增強機體的免疫功能；大量研究數據也表明，黃芪多糖可提高水產動物的質量增加率以及飼料的利用率。

2.2 黃芪多糖可促進細胞因子表達及分泌

細胞因子是一類由免疫細胞產生，能在細胞間傳遞信息、具有免疫調節功能的蛋白質或小分子多肽。它通過結合細胞表面相應的細胞因子受體而發揮生物學作用。近年來，魚體內檢出和推斷存在的細胞因子多達幾十種，研究較為深入的兩類魚類細胞因子是IL-1β[30-31]和TNF-α[32]，前者作為一種多效促炎細胞因子，在炎癥過程中起著重要作用，可以通過誘導淋巴細胞、相關組織細胞、血管內皮細胞和炎癥反應效應細胞的生長和發育，促進細胞調控免疫；TNF-α可增強吞噬作用、趨化作用以及溶菌酶合成等多種細胞反應。鯉魚注射不同劑量黃芪多糖后，檢測其細胞因子和免疫相關基因在不同組織中的表達。結果發現，黃芪多糖對IL-1β在鰓和脾臟的表達沒有顯著提升，但高劑量黃芪多糖可促進TNF-α在鰓和脾臟中的轉錄表達，低劑量和中等劑量的黃芪多糖分別可以促進C型溶菌酶在鰓和脾臟中的表達；并且頭腎中IL-1β和TNF-αmRNA表達量隨黃芪多糖劑量的增加而升高[33]。腹腔注射黃芪多糖，可誘導C型溶菌酶在吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)鰓、頭腎、肝臟和脾臟等組織中的表達[34]。攝食添加黃芪多糖飼料的鯽魚，其肝臟、脾臟、腎臟中總一氧化氮合酶、一氧化氮、誘導性一氧化氮合成酶含量明顯高于未添加組[29]。這些結果表明，雖然黃芪多糖的抗病作用受多因素相互調節的，但是促進細胞因子的表達進而提高魚類免疫仍作為其抗病機能的重要部分。

2.3 黃芪多糖可提高非特異性免疫能力

非特異性免疫是動物在進化過程中所形成的抵御抗原微生物侵入及殺滅、吞噬病原微生物的免疫能力，具有先天性和可遺傳性。

2.3.1 吞噬作用

巨噬細胞是魚類最重要的免疫活性細胞之一，其在識別、吞噬外來病原微生物，處理和呈遞抗原，激活淋巴細胞，啟動特異性免疫應答以及分泌免疫因子等方面發揮重要作用[35-37]。黃芪多糖作用于離體培養的鯉魚頭腎巨噬細胞，可顯著提高巨噬細胞的氧、氮呼吸暴發活性[38]。黃芪水提取液單獨使用時能刺激鯉魚頭腎中巨噬細胞增殖，卻不能刺激巨噬細胞的氧、氮暴發活性[39]。白東清等[40]發現，黃芪多糖能夠有效地提高黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)吞噬細胞的吞噬活性，并且隨黃芪多糖添加水平的添加而升高，用遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)攻毒后死亡率相比對照組顯著降低。

白細胞具有趨化性，當病原體侵入或自身組織壞死時，通過胞吞作用吞噬異物，其吞噬能力是魚類非特異性免疫功能的重要指標之一[41]。在羅非魚[28]基礎日糧中添加100、500、1000 mg/kg和1500 mg/kg黃芪多糖，試驗結果表明，黃芪多糖可以不同程度地提高羅非魚血液中白細胞的吞噬能力，第40 d時，1500 mg/kg黃芪多糖對白細胞的吞噬能力提高至112%。Ardó等[42]研究結果同樣表明，黃芪多糖可明顯提高尼羅羅非魚(O.niloticus)白細胞吞噬活性。相似的結果在大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[43]中也有發現。用不同劑量(100、150、200、250 mg/kg)的黃芪多糖投喂雜交鲌，30 d后250 mg/kg組鲌的白細胞吞噬活性提高最為顯著，并且用嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)攻毒發現，黃芪多糖能提高雜交鲌的免疫保護率[44]。以上研究結果與哺乳動物中的結果相似[45]，表明黃芪多糖可通過識別巨噬細胞表面受體，調節巨噬細胞活性，影響巨噬細胞和細胞因子的分泌，增強機體的免疫功能。

2.3.2 抗氧化作用

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽在細胞自由基損傷中起著關鍵作用[46]。黃芪多糖可以提高超氧化物歧化酶活性及總抗氧化能力[47]，對OH-和O2-自由基有清除作用，且在一定濃度范圍內，與黃芪多糖劑量呈正相關性[21]。Zahran等[48]發現，黃芪多糖可提高尼羅羅非魚超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、溶菌酶活性及丙二醛含量。樊英等[49]也發現，添加3%和5%黃芪多糖微膠囊可以提高仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔液中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、髓過氧化物酶活性；用燦爛弧菌(Vibriosplendidus)攻毒后對仿刺參的免疫保護率可分別達到66.67%和69.44%。在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)飼料中添加黃芪多糖時，添加600 mg/kg黃芪多糖能顯著提高鰓黏液中溶菌酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，提高機體的非特異性免疫能力[50]；在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[51]中也有相似報道。同時，在齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[3]、黃顙魚[43]、草魚[52]、鯽魚[53]、雜交鱧(Channamaculate♀×C.argus♂)[54]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[55]、中華鱉(Pelodiscussinensis)[56]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[57]以及凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[58-59]中均發現有相似的結果。目前關于多糖的抗氧化作用機制主要有兩種解釋，一種是OH-可以奪取多糖碳氫鏈上的氫原子結合成水，而多糖碳原子上留下單電子可繼續氧化形成過氧自由基，后者可進一步分解；另一種是多糖環上的羥基可與產生OH-等所必需的金屬離子絡合，從而抑制活性氧自由基的產生[60-61]。無論是哪種機制，黃芪多糖都可通過激活體內多種酶活性，及時清除自由基，減少氧化應激，提高機體免疫力，增強機體抗病能力。

3 黃芪多糖的應用

隨著黃芪多糖作用機理的深入研究，其在水產養殖中也得到了廣泛應用。中藥多糖主要通過注射法、灌注法、浸泡法和飼料投喂法等方式應用于水產養殖，但是由于水產養殖數量龐大，因此一般作為免疫增強劑添加到飼料中改善腸道菌群的組成，提高營養物質的利用率，促進魚體生長發育，增強魚體免疫力[62]。目前，水產動物病害仍以細菌性疾病為主，各種水生病原菌作為主要傳染性疾病病原，造成了巨大的經濟損失；嗜水氣單胞菌能引起許多淡水魚類的細菌性出血病，其傳播速度快、發病范圍廣，是淡水魚類暴發性傳染病最主要的病原菌之一。在日糧中添加不同含量的黃芪多糖，可以提高細菌感染的鯉魚[63]、黃顙魚[64]以及大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[65]等的存活率。白斑綜合征病毒是對蝦養殖中危害最大的一類病毒，可使對蝦短時間內大量死亡。凡納濱對蝦注射白斑綜合征病毒后，與對照組相比，0.2 g/kg 黃芪多糖顯著提高對蝦成活率，可見黃芪多糖能增強凡納濱對蝦抵抗白斑綜合征病毒的感染能力[66]。同時，周智愚等[67]發現，黃芪多糖能夠提高草魚母本免疫能力并向子代垂直傳遞，在應對草魚呼腸孤病毒感染時發揮一定免疫保護作用。研究表明，在飼料中添加黃芪多糖，可以增加羅非魚腸絨毛的長度[48]，增強其對營養物質的吸收；降低氧化損傷，提高抗氧化能力以及對肝組織保護作用[63]。水產動物疾病防控原則“防治結合，防重于治”，因此要主動發揮黃芪多糖對疾病的預防作用，同時也要加強對疾病治療作用的研究。

4 總結與展望

中草藥可增加不同魚類和貝類對細菌、病毒和寄生蟲的特異性和非特異性免疫能力[68]，在水產動物疾病防控中具有獨特優勢，已成為控制水產動物疾病發生的重要漁藥。中草藥黃芪不僅具有抗病和促生長作用，而且無任何毒副作用。黃芪多糖作為一種重要活性成分，可通過激活免疫細胞功能而增強機體免疫力。水產動物中黃芪多糖可促進巨噬細胞和白細胞的吞噬功能，也可促進干擾素的產生，抑制病毒繁殖。但是在水產養殖中使用的黃芪多糖多為粗多糖，多以免疫佐劑或飼料添加劑應用，研究還不夠深入。今后，黃芪多糖研究的重點應集中于：(1)利用現代化技術方法，對黃芪多糖進行提取分離，利用先進的研究方法對黃芪多糖結構進行深入研究，為黃芪多糖的開發應用奠定基礎；(2)深入研究黃芪多糖作用機理，理解其免疫增強的作用；(3)加強黃芪多糖與其他中草藥成分的配伍及其協同作用研究，研發出高效的抗病中草藥合劑，以使其更好地應用于水產動物疾病防控，從而減少疾病造成的漁業損失。