假交替單胞菌對哈維氏弧菌拮抗作用初探

楊 行，章 翔，龍 昊，李 瑩，馮永勤，謝珍玉

( 1.海南大學，南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228; 2.海南大學 海洋學院，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南 海口 570228 )

隨著海水養殖規模的擴大和養殖環境的持續惡化，養殖動物細菌性疾病呈暴發性流行，已成為制約全球海水養殖業可持續健康發展的重要因素，嚴重影響著海水養殖業的發展。其中弧菌病是海水動物養殖中危害最為嚴重的病害之一[1-3]。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)具有毒性大、耐藥性強、可侵染多種宿主的特點，已成為華南地區海水養殖最嚴重的細菌性病原之一[4-5]。為防治疾病，多采用抗生素和化學藥品控制弧菌病，結果不僅使養殖水體的正常菌群遭到破壞，還導致病原菌株的耐藥性增強，嚴重污染近岸海域生態環境[6-7]。因此，建立哈維氏弧菌病原的生態防控技術是當前確保我國華南地區海水養殖產業健康發展的必由之路[8]。

利用微生物間的拮抗作用開展生物防治，是防控水產細菌性病原的重要有效途徑[9-10]。目前應用于水產養殖上的拮抗菌制劑主要有兩大類：(1)單一制劑，如熒光假單胞菌(Pseudomonnasfluorescens)、中間氣單胞菌(Aerommasmedia)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)、溶藻膠弧菌(V.alginolyticus)、光合細菌、蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)等；(2)復合益生菌制劑，如美軍方、復合型活性生物凈水劑等，這類益生菌主要由硝化和反硝化假單胞菌、乳酸桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、反硝化細菌、枯草桿菌等菌株組成[11]。

近年來，自海南文昌地區中分離出的假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)WCPW15003對哈維氏弧菌的拮抗作用最為明顯[12]，但該菌在2216E培養基中的最高培養密度僅108cfu/mL，且針對不同密度弧菌病原的具體使用密度也未確定，難以實現規模化培養和應用。筆者將以2216E培養基為基礎，通過額外補充一定含量的碳源和氮源，優化假交替單胞菌WCPW15003的培養基組分；同時，確定不同密度弧菌病原所需要的最低拮抗菌密度，其結果將為今后開發防治熱帶海水養殖哈維氏弧菌病原的益生菌制劑及其施用技術奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

假交替單胞菌WCPW15003，分離自海南文昌水產養殖系統底泥樣品(深80 cm)；哈維氏弧菌PBVH3311分離自海南臨高某對蝦養殖基地[13]。以上2株菌種保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

取保藏于-80 ℃冰箱中的哈維氏弧菌PBVH3311和假交替單胞菌WCPW15003，接種于2216E液體培養基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養24 h。

1.2.2 活菌計數標準曲線測定

取10 mL活化后的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液或哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液，4000 r/min離心5 min，移除上清液，重懸于PBS溶液；進行二倍倍比稀釋，稀釋5個密度梯度，分別測菌懸液吸光值。將各稀釋梯度吸光值與其對應稀釋倍數進行線性相關分析，要求r2>0.98。采用平板計數法[14]檢測相應菌液中的活菌密度(cfu/mL)。根據菌懸液吸光值和活菌密度，繪制其活菌計數標準曲線[15]。

1.2.3 生長曲線測定

使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測定假交替單胞菌WCPW15003和哈維氏弧菌PBVH3311的生長曲線。操作如下：加350 μL的2216E液體培養基至蜂窩板，分別接種活化的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液和哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液各50 μL，充分吸打混勻，于30 ℃下，180 r/min振蕩培養72 h，每小時檢測1次吸光值，檢測波長為600 nm。設置3個平行組。

1.2.4 培養基優化

以2216E培養基為基礎培養基，其組分為：胰蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、磷酸鐵(0.01 g/L)，通過補加一定量的牛肉膏或(和)紅糖，組成假交替單胞菌培養基A、B、C(試驗組)(表1)。每組設置3個平行。

表1 假交替單胞菌培養基

注：“+”表示添加，“-”表示不添加.

接種1%(體積比)活化后的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液(密度為3×108cfu/mL)，振蕩培養(30 ℃，180 r/min)至對數生長晚期。采用標準曲線計數法，確定各組菌懸液密度。采用SPSS 18.0軟件對組間數據進行單因素方差分析和Duncan多重比較，統計值用平均值±標準差表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。

1.2.5 拮抗試驗

將活化的哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液稀釋后加入2216E半固體培養基(pH 7.6、鹽度30)中，制作成病原菌平板。病原菌平板密度設置為101～108cfu/mL 共8個10倍倍比稀釋密度。采用瓊脂擴散法[16]測定101～109cfu/mL 共9個10倍倍比稀釋的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液的拮抗作用效果，打孔直徑為5.98 mm。培養溫度為30 ℃，正置培養24 h，用數顯游標卡尺測量抑菌圈直徑(精確到mm)。設置3個平行組。采用Matlab軟件對數據進行回歸分析，擬合多元二次回歸方程。

2 結 果

2.1 活菌計數標準曲線繪制

2.1.1 假交替單胞菌WCPW15003活菌計數標準曲線

不同稀釋倍數菌懸液的吸光值與其對應稀釋倍數的線性方程為：y=1.8976x+0.137，r2=0.9877[x為假交替單胞菌WCPW15003稀釋倍數倒數的值，y為假交替單胞菌WCPW15003稀釋后吸光值(OD600)]；標準曲線方程為：y=134.36x-17.976，r2=0.9924[x為假交替單胞菌WCPW15003吸光值(OD600)，y為假交替單胞菌WCPW15003活菌菌落數]，菌液吸光值與活菌數之間有顯著線性關系(圖1)。因此，假交替單胞菌WCPW15003的菌懸液吸光值與其活菌數量間存在良好線性關系，可用于后續菌液密度的測定。

圖1 假交替單胞菌WCPW15003活菌計數標準曲線

2.1.2 哈維氏弧菌 PBVH3311活菌計數的標準曲線

不同稀釋倍數菌懸液的吸光值與其對應稀釋倍數的線性方程為：y=1.42x+0.2052，r2=0.981[x為哈維氏弧菌PBVH3311 稀釋倍數倒數的值，y為哈維氏弧菌PBVH3311稀釋后吸光值(OD600)]；標準曲線方程為：y=5.1028x-1.2664，r2=0.9956[x為哈維氏弧菌PBVH3311吸光值(OD600)，y為哈維氏弧菌PBVH3311活菌菌落數]，菌液吸光值與活菌數之間有顯著線性關系(圖2)。因此，哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液吸光值與其活菌數量間線性關系良好，可用于后續菌液密度的測定。

圖2 哈維氏弧菌 PBVH3311活菌計數標準曲線

2.2 菌株生長曲線

2.2.1 假交替單胞菌 WCPW15003生長曲線

假交替單胞菌WCPW15003的生長曲線符合典型“S”型細菌生長曲線。即假交替單胞菌WCPW15003的生長周期可分為停滯期、增長期、平臺期和衰亡期共4個時期。其中，接種后0～0.5 h為該菌株的停滯期，0.5～1.5 h為緩慢增長期，1.5～2.5 h進入短暫平臺期，2.5～10 h進入對數增長期，10～36 h進入平臺期，36 h后進入衰亡期(圖3)。

圖3 假交替單胞菌WCPW15003生長曲線

2.2.2 哈維氏弧菌PBVH3311菌株生長曲線

哈維氏弧菌PBVH3311的生長曲線符合典型“S”型細菌生長曲線。即哈維氏弧菌PBVH3311的生長生長周期可分為停滯期、增長期、平臺期和衰亡期共4個時期。接種后0～0.5 h進入停滯期，0.5～1.5 h進入增長期，1.5～4.5 h進入短暫平臺期，4.5～20 h進入對數增長期，20～44 h進入緩慢增長期，44～68 h進入平臺期，68 h后進入衰亡期(圖4)。

2.3 培養基優化

培養24 h后，不同假交替單胞菌WCPW15003培養基中菌懸液的密度為2.31×108～3.36×109cfu/mL(圖5)。其中2216E培養基的活菌數最低，為2.31×108cfu/mL；試驗組A的活菌數最高，為3.36×109cfu/mL；試驗組B的活菌數為1.33×109cfu/

圖4 哈維氏弧菌PBVH3311生長曲線

mL；試驗組C的活菌數為1.95×109cfu/mL。與對照組相比，3個試驗組的菌懸液密度均極顯著高于對照組(P<0.01)；盡管試驗組B和試驗組C間僅達到顯著性差異(P<0.05)，但試驗組A與試驗組B或試驗組C間均達到了極顯著差異(P<0.01)。

圖5 培養基優化結果

2.4 拮抗試驗

當哈維氏弧菌PBVH3311密度為101～102cfu/mL時，所有組別未出現明顯的拮抗效果。當哈維氏弧菌PBVH3311密度為103cfu/mL時，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度為103cfu/mL，抑菌圈直徑為(8.40±0.16) mm；當哈維氏弧菌PBVH3311密度為104、105cfu/mL時，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度均為105cfu/mL，抑菌圈直徑分別為(9.64±0.07)、(8.24±0.22) mm。拮抗作用效果為全透明抑菌圈(圖6)。

當哈維氏弧菌PBVH3311密度為106cfu/mL時，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度為107cfu/mL，抑菌圈直徑為(18.15±0.09) mm；當哈維氏弧菌PBVH3311密度為107、108cfu/mL時，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度均為108cfu/mL，抑菌圈直徑分別為(18.53±1.34)、(11.68±2.58) mm。拮抗作用效果為全透明抑菌圈，外側還有一圈半透明抑菌圈(圖6)。

總之，只有當哈維氏弧菌PBVH3311≥103cfu/mL時，假交替單胞菌WCPW15003才會產生拮抗作用，且假交替單胞菌WCPW15003的密度應相當于或高于哈維氏弧菌PBVH3311的密度，拮抗作用大小與假交替單胞菌WCPW15003密度呈正相關性。

表3 不同密度假交替單胞菌與哈維氏弧菌拮抗抑菌圈直徑(打孔器直徑5.98 mm) mm

注：表中數據為剔除掉打孔器外徑5.98 mm的結果，“0”表示不產生拮抗效果.

圖6 假交替單胞菌WCPW15003與哈維氏弧菌PBVH3311拮抗作用效果a.假交替單胞菌；b.哈維氏弧菌；c.全透明抑菌圈；d.半透明抑菌圈.

2.5 數據分析

(1)當哈維氏弧菌PBVH3311密度為103、104、105cfu/mL時(低密度弧菌)，擬合多元二次回歸方程，擬合結果為: f(x，y)=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2[f(x，y)為抑菌圈直徑(mm)，x為哈維氏弧菌PBVH3311密度(×103cfu/mL)，y為假交替單胞菌WCPW15003密度(×103cfu/mL)]。

當哈維氏弧菌PBVH3311密度為103、104、105cfu/mL時，若要實現100%拮抗效果，即r2=1(方程實際r2=0.9866)，此時f(x，y)=5.98×(1+0.0134)=6.06。因此，當哈維氏弧菌PBVH3311為103～105cfu/mL時，實現100%拮抗作用的方程應為：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2。

(2)當哈維氏弧菌PBVH3311密度為106、107、108cfu/mL時(高密度弧菌)，擬合多元二次回歸方程，擬合結果為：f(x，y)=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2[f(x，y)為抑菌圈直徑(mm)，x為哈維氏弧菌PBVH3311密度(×106cfu/mL)，y為假交替單胞菌WCPW15003密度(×106cfu/mL)]。

當哈維氏弧菌PBVH3311密度為106、107和108cfu/mL時，若要實現100%拮抗效果，即r2=1(方程實際r2= 0.9544)，此時f(x，y)=5.98×(1+0.0456)=6.25。因此，當哈維氏弧菌PBVH3311為106～108cfu/mL時，實現100%拮抗作用的方程應為：6.25= 8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。

3 討 論

3.1 拮抗菌WCPW15003及其培養基優化

哈維氏弧菌是南海近岸海洋環境中的優勢菌種之一[17]，也是華南地區海水養殖動物最常見的細菌性病原[4]，常引發對蝦發光病、對蝦早期偷死綜合征、石斑魚爛身病等多種嚴重疾病[18-19]。

革蘭氏陽性菌被廣泛應用于水產養殖業中，其中應用較為普遍的主要是乳酸菌和一些芽孢桿菌等。Zokaeifar等[20]報道，將兩株芽孢桿菌以108cfu/mL密度添加到飼料中，投喂8周齡凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)時，能夠促進其生長及提高消化酶活力，且對哈維氏弧菌有明顯抑菌活性。雖然革蘭氏陰性菌在水產養殖中的應用相對較少，但有些假交替單胞菌屬菌種等也是公認的益生菌。Fjellheim等[21]報道，假交替單胞菌對大西洋鱈(Gadusmorhua)生長環境中的鰻弧菌(V.anguillarum)具有拮抗作用；Kesarcodi-Watson等[22]報道了假交替單胞菌可保護貝類幼苗免受燦爛弧菌(V.splendidus)的侵染；其他的研究結果也表明，假交替單胞菌對哈維氏弧菌、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)等多種病原體有顯著拮抗作用[23-27]。這與本研究結果基本一致，即假交替單胞菌WCPW15003對哈維氏弧菌PBVH3311具有明顯的拮抗作用。

在大多數養殖系統中，只有當弧菌密度超過104cfu/mL時，才易暴發養殖動物弧菌病；同時，通過回歸方程可得知，假交替單胞菌WCPW15003密度應大于或等于養殖水體中弧菌密度，才會表現出明顯的拮抗效果。因此，提高菌液中菌體密度是實現假交替單胞菌WCPW15003應用的必要前提。盡管2216E是絕大多數海洋細菌的培養基[28]，但由于營養成分含量相對單一，不適宜假交替單胞菌WCPW15003的高密度培養。筆者通過對2216E培養基的優化，可使假交替單胞菌WCPW15003密度由2.31×108cfu/mL升至3.36×109cfu/mL，可基本滿足假交替單胞菌WCPW15003規模化培養和在小水體應用的要求，為今后建立該拮抗菌的連續發酵培養和生產應用奠定了重要基礎。

3.2 拮抗菌WCPW15003對哈維氏弧菌病原拮抗機制

在基于培養皿的拮抗試驗中，當病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度為103～105cfu/mL時，抑菌圈為清晰的全透明圈；當病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度大于106cfu/mL時，抑菌圈為兩個同心圓，全透明圈在內，半透明圈在外。據此推測，當病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度較低時，拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003通過識別弧菌并分泌胞外產物啟動了第一套具有殺菌作用的拮抗機制，實現了低密度的拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003的拮抗作用，擬合方程為：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2；當病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度較高時，拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003除啟動上述第一套拮抗機制外，還同時啟動了具有抑菌作用的第二套拮抗機制，且該機制分泌的胞外產物在瓊脂中的擴散速度大于第一套拮抗機制分泌的胞外產物，因此，產生半透明抑菌圈大于全透明圈的現象，此時的擬合方程為：6.25=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。這一結果為后續開展該拮抗菌作用機制的研究奠定了重要基礎。同時表明，該拮抗菌既可殺滅貧營養海水中的少量弧菌，又可抑制富營養海水中出現高密度的弧菌，還可保持富營養水體中剩余少量弧菌(承擔養殖水體的物質循環作用)，從而有利于成功構建基于細菌的“活水”的養殖系統。也就是說，該拮抗菌今后不僅可用于養殖前期的海水消毒，還可用于養殖水體中弧菌密度控制，防止因高密度弧菌引發海水養殖弧菌病的暴發，且不會導致水體因完全缺少細菌而成為“死水”。

總之，本研究不僅確定了假交替單胞菌WCP15003的生長特性及其對哈維氏弧菌PBVH3311存在顯著的拮抗效果，還根據不同弧菌密度率先確定了該拮抗菌對弧菌的多元二次回歸方程，可根據養殖水體中弧菌密度，確定拮抗菌的準確使用量，這為假交替單胞菌WCPW15003在生產中精準施用技術開發夯實了理論基礎。