日本七鰓鰻毒素肽rLj-RGD3突變體rLj-115基因的克隆與表達

李姿其，衣龍達，米梓萌，于 卓，周沫含，王繼紅，肖 蓉

( 遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081 )

RGD毒素肽是一類具有RGD(Arg-Gly-Asp三肽序列)特征性模體的活性肽，最初發現于蛇毒中，被稱為去整合素。隨著研究的深入，科研人員在一些吸血類生物諸如蜱、牛虻、水蛭等的唾液腺中也同樣發現了這種以RGD模體為特征的毒素肽[1-5]。而rLj-RGD3是本課題組在國際上率先發現的來源于日本七鰓鰻(Lampetrajaponica)口腔腺的RGD肽，其一級結構包含3個RGD序列[6]。據文獻報道，腫瘤細胞膜表面的整合素與正常細胞相比具有表達上調的特點，而這種高表達的整合素與腫瘤細胞細胞外基質蛋白的RGD序列結合，能夠使腫瘤微環境中生長因子的信號從細胞外向細胞內傳遞，進而促進腫瘤細胞增殖及遷移等活動。當外源性RGD毒素肽進入到腫瘤組織細胞附近時，由于其序列上具有與細胞外基質蛋白相同的RGD模體，故其能競爭性地與腫瘤細胞表面整合素結合，從而對整合素介導的信號通路起到抑制作用，進而腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲也受到抑制，最終誘導腫瘤細胞發生凋亡。因此RGD毒素肽具有抑制血管新生、抑制腫瘤生長的功能[7-10]。本課題組的前期工作證實rLj-RGD3也同樣具有上述功能[11-16]。

由于Lj-RGD3含有3個RGD模體，其結構上的這幾個RGD是否都是其功能所必須，是否以協同效應累加其功能，還是以某個RGD為功能關鍵模體，這些問題引起了筆者的關注。為此，筆者進行了一系列的突變體構建，本研究所涉及的是Lj-RGD3的第Ⅰ及第Ⅱ位RGD同時缺失的突變體的分子克隆與誘導表達，并將獲得突變體命名為rLj-115。rLj-115的獲得將對后續關于Lj-RGD3的結構與功能的研究提供物質基礎，并且也可為以rLj-RGD3為原型的抗血栓、抗腫瘤生物制藥研究提供更多可供優化篩選的候選素材。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

質粒pET23b、大腸桿菌(Eascherichiacoli)BL21為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

質粒提取試劑盒、DNA連接試劑盒、IPTG(寶生物大連公司)；Amp氨芐青霉素(哈藥集團)；咪唑、Tricine、蛋白質marker、CaCl2(Amresco公司)。組氨酸親和層析柱(His·Bind Column,Novagen公司)。

1.1.3 儀器

氣浴恒溫振蕩器(Thermo)；漩渦振蕩器(Scientific Industries)，低溫高速離心機(Beckman Coulter)；高溫高壓滅菌鍋(博訊)；分光光度計(Eppendorf)。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變基因全序列合成

由于Lj-RGD3含有大量重復序列，無法對其基因進行定點突變，故采用人工合成方法獲得目的基因(寶生物大連公司完成)。PCR擴增時引入NdeⅠ和HindⅢ雙酶切位點。

1.2.2 陽性重組質粒構建與鑒定

1.2.2.1 陽性重組質粒構建

利用雙酶切法將合成后的rLj-115基因連接到pET23b質粒上，雙酶切的酶切位點為NdeⅠ和HindⅢ。酶切反應體系見表1及表2。

表1 HindⅢ的酶切反應體系

表2 NdeⅠ的20 μL酶切反應體系

以3倍體積的無水乙醇沉淀回收雙酶切后的DNA片段與pET23b載體，以T4 DNA連接酶進行16 ℃的過夜連接(表3)。

表3 20 μL連接酶反應體系

1.2.2.2 陽性重組質粒鑒定

采用CaCl2法將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21中：宿主菌大腸桿菌BL21接種于20 mL Amp-LB中培養過夜，次日將部分菌液移至50 mL LB培養液中于37 ℃下繼續培養至600 nm吸光值達到0.2～0.3。培養物置于冰上10 min，5000 r/min，4 ℃離心10 min。棄上清液，倒置離心管1 min，加入5 mL冰預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液致敏并懸浮細胞，冰上10 min。5000 r/min 4 ℃離心10 min回收細胞，棄上清液，每25 mL的原培養物再加入2 mL冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，懸浮細胞并置于冰上3 h，每份200 μL分裝細胞。加10 μL含40 ng的DNA溶液至200 μL感受態細胞中溫和混勻，于42 ℃熱休克90 s后迅速放回冰中，將細胞冷卻1～2 min后，加入800 μL LB(Amp-)培養基，37 ℃ 225 r/min搖蕩培養細菌45～90 min。取100 μL轉化產物鋪于90 mm的LB(Amp+)瓊脂平板上，室溫下放置20～30 min后，倒置平皿于37 ℃培養12～16 h，待LB(Amp+)瓊脂平板上長出菌落后即可進行陽性轉化子的篩選鑒定。

采用滅菌牙簽挑取轉化菌于10 μL雙蒸水中并煮沸10 min作為PCR模板，運用通用T7引物PCR法進行鑒定。T7通用引物序列為：P1-XXaaattaatacgactcactata，P2-XXgctagttattgctcagcggtg。DNA測序由寶生物大連公司完成。

1.2.3 重組蛋白rLj-115的誘導表達與純化

1.2.3.1 重組蛋白rLj-115的誘導表達

挑取陽性重組單菌落接種于含氨芐的LB培養基中，于37 ℃培養至600 nm吸光值為0.4～0.6時，達到對數生長期。加IPTG至終濃度1 mmol/L，分別進行3、4、5 h的37 ℃誘導表達與30 ℃的低溫過夜誘導表達。取上述培養液5000 r/min離心5 min，于沉淀中加100 μL的上樣緩沖液100 ℃加熱3 min, 上樣行Tricine-SDS電泳。

1.2.3.2 重組蛋白rLj-115的純化

由于rLj-115含有組氨酸標簽，故可采用組氨酸親和層析柱進行純化。組氨酸標簽可與固相化于Ni-NTA His·Bind樹脂上的Ni2+結合，雜蛋白被洗掉后，目標蛋白可通過濃度逐漸提高的咪唑洗脫而重新獲得。采用Trincine SDS-PAGE法電泳，采用考馬斯亮藍標準曲線法進行濃度測定。

1.2.4 對ECV304增殖抑制作用的測定

將ECV304接種于96孔板，于M199培養液中培養至對數生長期。加入梯度濃度的 rLj-115繼續培養24 h后加入MTT溶液繼續培養4 h，吸去培養液并加入等體積的二甲基亞砜，搖床振蕩使結晶充分溶解，使用酶標儀于490 nm下測定吸光度。計算細胞殺傷率：

R=(C-T)/C×100%

式中,R為細胞增殖抑制率，C為空白對照組的吸光度，T為加藥組的吸光度。

用SPSS軟件統計數據，n=3。

2 結 果

2.1 Lj-115突變方案及基因全序列合成

Lj-RGD3的一級結構由118個氨基酸組成，含有3個RGD模體且富含組氨酸。將Lj-RGD3前兩個RGD模體缺失、保留第3個RGD的突變體命名為Lj-115(圖1)，其基因序列采用人工合成(寶生物公司完成)方法獲得。

圖1 源于Lj-RGD3的突變體Lj-115的基因序列及其氨基酸序列

2.2 陽性重組質粒鑒定

Lj-115的333 bp基因片段插入pET23b質粒后，T7通用引物的PCR擴增產物片段長度應該為526 bp，而pET23b空質粒因沒有外源基因片段的插入，其T7通用引物PCR擴增產物僅有193 bp，故可依據T7通用引物的結果進行陽性重組子的判斷。試驗結果顯示，重組菌為陽性克隆菌(圖2)。

圖2 利用T7通用引物對陽性重組子進行的PCR鑒定1.DL2000 DNA Marker(Takara); 2.陽性重組子.

2.3 陽性重組質粒測序鑒定

重組質粒測序結果見圖3，表明構建序列完全正確，Lj-115基因克隆成功完成。

2.4 重組蛋白rLj-115的誘導表達和純化

通過CaCl2轉化法將pET23b-115轉入BL21表達菌內，通過終濃度1 mmol/L的IPTG誘導，在37 ℃ 3～5 h誘導及30 ℃低溫誘導表達過夜條件下都成功誘導表達了基因重組肽rLj-115。結果表明，37 ℃誘導表達4～5 h蛋白產生量最高，為最佳誘導條件(圖4)。

圖3 pET23b-115重組質粒測序圖

圖4 突變體rLj-115 BL21/pET23b菌體的IPTG誘導的Tricine SDS-PAGE電泳圖1.30 ℃過夜未誘導； 2.30 ℃過夜誘導； 3.37 ℃ 3 h未誘導； 4.37 ℃誘導3 h； 5.MAKER; 6.37 ℃未誘導培養4 h; 7.37 ℃誘導培養4 h; 8.37 ℃未誘導培養5 h; 9.37 ℃誘導培養5 h. 目的條帶以箭頭標示.

經過菌體收集、超聲破碎和Ni2+親和層析純化等試驗步驟，獲得了純化的基因重組肽rLj-115。Tricine-SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，rLj-115的分子量為13.7 ku，電泳遷移率由于序列帶有大量堿性氨基酸，所以比預期滯后。rLj-115純度超過98%(圖5)。通過Bradford法測定蛋白質量濃度為3 mg/mL。

2.5 rLj-115對ECV304細胞增殖的抑制作用

MTT能還原存在于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶從而形成甲瓚，其在呈藍紫色沉淀于細胞中。死細胞由于酶的失活而無此現象。所以形成的藍紫色甲瓚結晶的量與活細胞的數目成正比。rLj-115作用于ECV304細胞的結果顯示，其可以劑量依賴方式抑制ECV304細胞的增殖(圖6)，其抑制細胞增殖的半數抑制濃度為0.15 μmol/L，說明重組表達的蛋白具有抑制血管新生的活性，為后續試驗奠定了物質基礎。

圖5 鎳離子親和層析純化得到rLj-115肽的Tricine-SDS-PAGE電泳1.Marker; 2～4.rLj-115純化蛋白.

圖6 rLj-115對人臍靜脈內皮細胞ECV304增殖的抑制作用

3 討 論

3.1 rLj-RGD突變體設計

RGD(Arg-Gly-Asp三肽序列)毒素肽是一類具有RGD特征性模體的活性肽，最初發現于蛇類唾液腺分泌物中。蛇類體內發現的RGD肽稱為去整合素。此外在水蛭、牛虻、虱等吸血類生物唾液腺中液也發現這種特征蛋白。rLj-RGD3是本實驗室在七鰓鰻口腔腺cDNA文庫中發現，并成功進行原核表達的可溶性RGD活性肽,結構中包含3個RGD模體。在之前的研究中，rLj-RGD3顯示出具有抑制血小板聚集、體內外抑制多種腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、喉癌)、體外抑制內皮細胞和體內抑制血管新生的功能[6,11-16]。由于rLj-RGD3具有3個RGD模體，因此其結構與功能的關系引起了研究者的關注。課題組設計了一系列的結構突變體，如保留第1個RGD模體的和保留第2個RGD模體的突變體，而本研究的rLj-115是保留第3個RGD模體的突變體。這幾個突變體獲得后，本課題組將對其進行全面的功能比較，所以突變體純化蛋白的獲得成為關鍵。

3.2 突變體基因的人工合成

在進行重組蛋白基因克隆與表達時，在未知其蛋白mRNA全長序列的情況下，通常采用5′-Race及3′-Race的方法釣取mRNA，然后采用RT-PCR方法獲得蛋白的雙鏈DNA基因并進行質粒構建，而相關突變體的構建往往是直接通過點突變完成[17-18]。本課題的Lj-RGD3野生型基因就是通過mRNA的RT-PCR方法獲得[6]。然而，在設計突變體克隆方案時發現，由于Lj-RGD3基因具有大量重復序列，無法采用定點突變完成。但前期本課題組已知Lj-RGD3的基因序列，故可在基因突變方案形成后采用全突變基因序列合成獲得目的基因。由試驗結果來看，合成基因構建成功，所表達的蛋白具有活性。這說明完全可以通過基因合成的方式進行重組蛋白的質粒構建。

3.2 突變體rLj-115的電泳遷移率及活性

突變體rLj-115含有大量堿性氨基酸，其等電點為10，故電泳遷移位置比預期滯后，這種現象在其野生型rLj-RGD3也同樣存在。MTT試驗結果表明，rLj-115抑制臍靜脈內皮細胞增殖的半數抑制濃度為0.15 μmol/L，而野生型rLj-RGD3作用于ECV304的半數抑制濃度為0.889 μmol/L[6]，rLj-115的活性是rLj-RGD3的6倍，這表明rLj-RGD3并未因3個RGD模體的同時存在而活性更強，這為后續進一步關于rLj-RGD3結構與功能的研究提供了試驗基礎。

4 結 論

本試驗成功地對rLj-RGD3的第Ⅰ、Ⅱ位RGD模體進行了缺失突變，獲得了僅含有第Ⅲ位RGD模體的rLj-115純化蛋白，并且rLj-115具有高于野生型6倍的生物活性，這為進一步的rLj-RGD3構效關系測定奠定了物質基礎，也為以rLj-RGD3為原型的抗腫瘤藥物優化篩選提供了候選素材。