白念珠菌生物被膜治療研究進展

姜佳玉 王汐文 唐希遠 陳麗華.*

(1 中南大學湘雅醫學院檢驗系，長沙 410013；2 中南大學湘雅醫學院麻醉系，長沙 410013)

白念珠菌(Canidia albicans)是一種條件致病性真菌，存在于正常人口腔、上呼吸道、陰道及皮膚黏膜表面，于正常人群無害，易導致癌癥、艾滋病和器官移植等免疫功能嚴重低下的患者發生口腔念珠菌病、念珠菌性陰道炎等真菌感染。近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用，免疫性疾病的逐漸增加，器官移植的發展，各種植入性醫學材料的使用以及醫務人員對真菌感染診斷技術的提高，臨床上的真菌感染愈發增多[1]。全球每年約有4000萬例念珠菌感染患者，其中白念珠菌是最主要的病原體約占總病例的50%～70%[2-4]，給人類健康帶來極大威脅。形成生物被膜的白念珠菌對抗菌藥物和生物殺傷劑的耐受性更是顯著提高，對常用的唑類藥物如氟康唑、伊曲康唑、酮康唑等的耐藥性顯著增加[5]。而且，生物被膜狀態下的白念珠菌能逃避宿主的免疫攻擊[6]。這些特性使得感染持續存在，這對于白念珠菌的治療是一個極大的挑戰。因此，探索白念珠菌生物被膜治療方法對臨床白念珠菌感染治療大有裨益。

1 白念珠菌生物被膜的形成

生物被膜又稱生物膜(biofilm)，是指微生物黏附在組織表面時，由自身產生的大量胞外基質包裹有特定功能和結構的菌細胞所形成的結構。生成生物膜是菌細胞在長期進化過程中為適應環境變化而形成的一種生存方式[7]。典型的白念珠菌生物被膜結構大致由3部分組成，即物體表面的數層酵母相細胞黏附形成基底部，內部的菌絲形成中間層，最外層由大量胞外基質覆蓋[8]。

白念珠菌生物被膜的形成過程可分為以下4步：首先，白念珠菌通過可逆的疏水作用和靜電力來進行黏附，其分泌孢子黏附在物體表面，對非生物表面的黏附主要由疏水相互作用介導，而對生物表面的黏附則由黏附素如凝集素控制；其次是微菌落的形成，細胞自身分泌的胞外聚合物具有黏結錨定作用，可使單個真菌細胞形成真菌團，多個真菌團塊形成肉眼可見的菌落；然后是以聚合物的產生和分泌為特征的時期，分泌的胞外基質逐漸增多，形成由孢子、菌絲體和假菌絲組成的高度結構化的三維網狀系統；最后，白念珠菌可以從物體表面分離(作為單細胞或聚集體)，成為浮游生物，并在新的表面定居進而形成新的生物膜[9](生物膜的擴散)。生物被膜狀態的白念珠菌在各種表型如形態結構、理化性質、致病性、毒力大小、藥物敏感性等及基因型上均與浮游狀態菌有顯著差異[10]，故其治療難度也更高，所以需要探究不同的治療方法。

2 白念珠菌生物被膜的治療

2.1 藥物治療

2.1.1 抗真菌藥物

多項研究結果顯示，由于白念珠菌生物被膜形成后產生耐藥性，大多數目前使用的抗真菌藥物對白念珠菌形成的生物膜的治療效果都不明顯。因此，需要開發治療耐藥生物膜的新策略。抗白念珠菌生物被膜的新型抗菌藥物——兩性霉素B脂質體具有脂溶性，穩定性強，能穿透白念珠菌等真菌形成的生物被膜，與真菌細胞膜上的麥角固醇結合，改變細胞膜的通透性，使細胞內容物流出，細胞死亡，表現出良好的治療效果[11]。臨床研究表明，兩性霉素B脂質體治療白念珠菌感染的總有效率為77.78%[12]。另有棘白菌素類藥物逐漸被應用于白念珠菌生物被膜狀態的感染，主要有卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈，此類藥物能夠阻礙白念珠菌與上皮細胞之間的黏附，抑制白念珠菌生物和非生物的黏附，阻止芽管的形成[13]，并從而抑制生物被膜的形成，是一類極具前景的新型抗真菌藥。

2.1.2 中藥有效成分

我國在天然植物及其提取物的藥用方向上具有悠久的歷史，且在不斷的發展和探索中藥在感染性疾病方面的應用，目前中藥已經成為抗真菌藥物開發的新方向。殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由蝦蟹等殼類生物的殼經過脫乙酰作用得到的聚合物，其可以抑制白念珠菌生物被膜的形成并且通過對抗生素的修飾增強對生物被膜的破壞效果[14]。復方百膚青已經成為治療陰道念珠菌病的輔助藥物，研究顯示250g/L的百膚青能明顯破壞白念珠菌的生物被膜，達到治療的效果[15]。中藥穿心蓮中的穿心蓮內酯可以通過線粒體途徑誘導白念珠菌生物膜的凋亡，促進ROS生成誘導凋亡，并且可以促進生物膜的分散[16]。赤芍的主要成分芍藥苷[17]和厚樸冷浸液[18]均可以破壞生物膜結構的穩定性，抑制牙管和菌絲的形成，抑制白念珠菌的黏附繼而抑制生物膜的形成。

2.1.3 益生菌

益生菌(probiotics)，指可維持宿主腸道微生物均衡并對宿主有益的活性微生物，如乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、酵母菌等，其對人體健康有極大的保護作用，在預防生殖系統感染、增強人體免疫力、幫助消化吸收、增強新陳代謝等方面已有廣泛的應用。益生菌已成為近年來抑制生物被膜治療的研究熱點。

研究發現益生菌可以抑制生物被膜的形成，其中乳酸桿菌應用得到了極大認可。Krzysciak等[19]報道唾液乳桿菌可以抑制致齲齒的變異鏈球菌和白念珠菌混合菌的生物被膜的形成，通過抑制白念珠菌形成假菌絲和牙管來降低白念珠菌的致病性。Wasfi等[20]報道干酪乳桿菌、羅氏乳桿菌、植物乳桿菌和唾液乳桿菌通過降低胞外多糖，酸耐受和群體感應相關的基因抑制致齲齒的變異鏈球菌的生物膜形成。Rossoni等[21]檢測了30株分離自無齲齒人群的乳酸桿菌對白念珠菌生物被膜形成的抑制作用，發現其可通過下調ALS3、HWP1、CPH1和EFG1基因的表達來抑制生物被膜的形成。臨床上已有用抗菌藥物聯合乳酸桿菌治療念珠菌感染的病例報告。有報告顯示，臨床上分別使用益康唑[22]和甲硝唑[23]聯合乳酸菌陰道膠囊治療念珠菌陰道炎時，發現加用乳酸菌輔助后治療總有效率提高了，復發率降低了。這顯示了乳酸桿菌在白念珠菌治療中的作用已被承認，未來將有更大的研究空間。

2.1.4 新型抗菌膜劑

目前，研究人員已經開發出大量具有獨特結構的潛在抗菌膜劑，它可以促進預先形成的生物膜的分散或者抑制體內新生物膜的形成，在分散現有生物膜或防止細菌在體外形成生物膜方面顯示出巨大的前景。Bendaoud等[24]研究出一種可以抑制其自身生物膜形成的多糖,調控生物膜結構，介導細胞在擴散階段的釋放，抑制如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌和白念珠菌的生物膜形成。既能使已形成的生物膜的分散又能殺死生物膜細菌的抗菌膜劑還可以與有效的抗微生物藥物組合以增強其活性來治療生物被膜。另有研究發現，(1)-N-2-甲氧基芐基-1,10-菲咯啉溴化物或可作為抗白念珠菌的新型抗菌膜劑。其作為螯合劑破壞生物膜中細胞的結構，抑制蛋白酶的功能，干擾了多種生物系統的功能，發揮出抗菌作用。在實驗中用掃瞄電子顯微鏡(SEM)圖像證實了其能導致白念珠菌生物膜基質破壞[25]。

2.1.5 作用于生物被膜基質的藥物

生物被膜豐富的胞外基質具有保護其內部的真菌，避免抗菌藥物破壞真菌細胞的作用，故在治療時常表現出一定的耐藥性。生物膜細胞的耐藥性增加已經被解釋為抗菌劑通過生物膜基質的延遲滲透。抗菌劑必須通過水通道擴散通過細胞外基質才能到達細胞。當目標細胞位于生物膜中時，基質可以作為抗微生物化合物的屏障。此外，基質成分也可以直接結合抗微生物劑導致耐藥。因此可以開發作用于被膜基質的藥物，加速生物被膜的裂解，減弱被膜的阻隔作用；或者通過改變被膜基質的通透性或厚度加速藥物的滲透，使進入被膜內的藥物達到抑菌濃度，使藥物發揮應有的作用。理論上治療白念珠菌被膜感染的關鍵在于破壞被膜后直接殺菌。有研究人員決定運用酶消化生物被膜基質的方法來觀察被膜基質的保護作用，由于胞外基質中含有DNA且與生物被膜結構的維持和保護其三維立體結構的穩定性有關，故實驗中比較用傳統抗生素治療及加用DNA酶聯合治療的效果，發現由于DNA酶破壞了被膜基質的結構，抗菌的效果非常顯著[26]。另有研究發現，細菌自身可以產生一種降解生物被膜多糖的水解酶。實驗中將該糖苷水解酶加入到已形成生物被膜的菌落，可以直接破壞生物被膜結構的穩定性，使其裂解消亡[27]。對真菌生物被膜基質結構，形成方式，形成特點的研究有助于找到突破其基質的方法，發現治療生物被膜的新方法。

2.2 生物醫學材料的改良

生物被膜常常形成于植入的醫學生物材料表面。它會導致植入失敗，造成大量的經濟損失，給患者身體帶來極大負擔，造成很多不良后果。大多數真菌細胞都能夠黏附與定殖于常用生物醫學材料表面，從而形成生物被膜繼而產生耐藥性。如果可以對現有的植入材料進行改進，阻止病原菌的附著，即可以避免生物被膜的形成。生物醫學材料改良的主要策略是表面覆蓋涂層隔絕真菌和材料表面的接觸或者是緩慢釋放抗菌藥物持續阻止被膜的形成。超高分子量聚乙烯(UHMWPE)用低壓氮等離子體處理可以提高抗生物污損性。用該材料進行大腸埃希菌生物膜形成的研究，并使用光學顯微鏡和原子力顯微鏡(AFM)對其成像。與未處理的聚合物相比，等離子體處理顯著減少了表面上的細菌附著。這可歸因于表面疏水性降低阻止了細菌與表面的相互作用[28]。研究證明納米銀粒子具有廣譜快速強效的殺菌作用且無耐藥性，具有抵抗真菌生物被膜的活性，可以抑制植入導管上生物被膜的形成，目前已投入臨床使用[29]。研究人員將鍍銀縫合袖套植入了一只人工感染的豚鼠體內，其產生的炎癥比未涂覆的織物少[30]。這些研究成果揭示了可以對生物醫學材料進行改進和完善，以達到防止植入材料上的白念珠菌生物被膜感染的目的。

2.3 其他療法

光動力治療(photodynamic therapy,PDT)是目前常用于治療尖銳濕疣，眼底病變和腫瘤等疾病的方法。由于其操作安全簡單、非特異、不易產生耐藥現象，具有治療耐藥菌株的作用，所以也逐漸用于抗菌治療中。有研究以白念珠菌生物膜為模型，在不同波長的紅光下，照射不同時間，探究光敏劑對生物膜的殺傷作用，用菌落計數法比較殺菌率。發現光敏劑TBO在633nm紅光下對白念珠菌生物膜具有顯著殺傷效果[31]。另有研究是用激光共聚焦掃描顯微鏡探究在5-氨基酮戊酸光動力療法(ALA-PDT)過程中不同光照劑量對白念珠菌生物被膜活性的抑制作用，定量分析ALA-PDT對白念生物膜的殺傷作用。最終發現ALA-PDT能夠對生物膜內的細胞產生破壞作用并且可以直接作用于生物膜[32]。目前光動力療法在抗白念珠菌生物被膜方面已有一定的研究成果，并且已經應用于臨床具有重要的臨床意義，相信它會在抗被膜方向成為一個研究熱點。

3 結語

臨床治療生物被膜形成狀態的白念珠菌感染非常困難，給患者的身心健康帶來極大的挑戰，因此亟需尋求一個合適有效的方法。目前在抗真菌藥物領域兩性霉素β-脂質體和棘白菌素類藥物均廣泛應用，中藥運用方面，肉桂、赤芍、穿心蓮等藥物有一定的輔助作用，生物被膜結構和形成方面及生物醫學材料的改良等領域也均有一定的研究成果，但在治療生物被膜狀態的白念珠菌感染時常遇到耐藥的瓶頸，研究人員對生物被膜形成機制的研究和抗被膜藥物的開發將有助于解決其治療過程中的耐藥問題，促進患者的康復，保護人類的健康。