解析植物組織培養中褐變現象的產生機理及克服方法

薛 棪

（荊楚理工學院，湖北 荊門 448000）

引言

褐變現象對植物的生長具有極大危害，是植物組織培養實踐中的重難點問題。據此，為了提升植物組織培養的順利運行，降低植物體因褐變現象而衰弱或死亡的情況發生，我們有必要對植物組織培養中褐變現象的產生機理與客服方法進行討論解析。

1 植物組織培養中褐變現象的產生機理

植物組織的褐變現象可由產生機制的差異分為非酶促褐變與酶促褐變兩種。其中，所謂“非酶促褐變”，即沒有酚類底物的干預，植物體本身由于缺水、衰老、寒冷等原因而發生的細胞死亡，如蘋果因過度成熟而形成褐變、荔枝因失水pH值持續上升而形成的褐變等。所謂“酶促褐變”，即在酚類底物的干預之下，經過酶催化而引發的褐變，此類褐變現象在植物組織培養中出現的幾率較高。從產生機理來看，酶促褐變的出現與酶、酚類底物、氧氣三個要素息息相關。經業內長期的研究與實踐發現，引起植物組織褐變現象的酶主要有多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶以及過氧化物酶三種，其中尤以多酚氧化酶最為常見。引起植物組織褐變現象的酚類底物主要有苯基羧酸、苯丙烷衍生物以及黃烷衍生物三種。

若植物組織處在健康的生長狀態時，即便其體內同時存在酶、酚類底物與氧氣，通常也不會出現褐變現象。究其原因，主要是酶與酚類底物分布區域不同，前者多處在細胞的液泡中，而酚類底物則處在細胞質及細胞間質中。但植物組織健康的細胞結構被打破、細胞膜出現破損時，酶與酚類底物便保有了接觸的條件，進而在氧氣的催化作用下形成醌，導致細胞出現脫水、聚合等異常反應，最終生成黑褐色的病變物質，引發植物組織的褐變現象。此外，經相關學者對金花梨、蒼溪梨等植物的研究發現，褐變現象的出現幾率、發生程度存在一定規律性，與酶的活性和酚類底物的含量相關[2]。

2 植物組織培養中褐變現象產生的影響因素

2.1 植物本身的影響

第一，植物的類別及品種的影響。與草本植物相比，木本植物更容易發生褐變現象。經周俊輝等學者的專項研究表明，寬皮桔、東北紅豆杉、牡丹、荔枝、蘋果、銀杏、獼猴桃等木本植物的褐變現象較為普遍。木本植物之所以更容易發生褐變現象，主要是因為其細胞中木質素、單寧等酚類底物的含量較高。此外，在進行柑橘屬木本植物的培養研究中發現，寬皮桔的褐變現象最為嚴重，葡萄柚、橘橙辭職，甜橙的褐變程度相對較輕。由此可見，在同一類別之下，不同品種植物的褐變程度存在很大不同。究其原因，應是受到不同品種植物細胞組織中酚含量的差異影響。

第二，植物體積及破壞程度的影響。通常來講，植物的體積越小，其細胞結構越密集，褐變現象的發生幾率也就越大。反之，植物的體積越大，其細胞破壞后酶與酚類底物越難接觸，褐變現象的發生幾率也就越小。同時，經實踐研究表明，培養中植物體的切口面積也會對褐變現象產生影響。例如，當金冠蘋果的切削口徑處在0.5毫米以下時，其褐變現象最為嚴重，且較已易引起蘋果的局部失活或整體死亡；當金冠蘋果的切削口徑處在5毫米至15毫米的區間內時，其褐變現象的發生幾率最低，且褐變后的死亡率也降至10%左右。但從既往經驗來看，這一規律并不是普適的。例如，桉樹葉片的切削面積越大，其酚類底物的產生數量越多，褐變現象也就越嚴重。

第三，植物生長狀態的影響。通常情況下，酶與酚類底物兩大褐變要素會隨著植物體的生理變化而變化，當植物年齡增長、木質化加劇時，其內部的酶與酚類底物含量也會隨之升高。因此，幼齡期植物的褐變程度往往最輕，這一點也在山核桃、桉樹等植物的培養研究中得到了有力證實。同時，相關人員在采集培養所需的植物材料時，所選時節的不同也會影響到植物后續的褐變程度。一般來講，夏季的環境氣溫較高、光照充足，植物的代謝活動旺盛、光合作用較強，其細胞中酶的活性也有所升高。若在此時采集植物材料，褐變現象的發生幾率將顯著增加。相比之下，秋冬季節的氣溫較低，空氣也相對干燥，因此植物大多代謝緩慢，甚至處在半休眠的狀態當中。若相關人員選擇此時作為植物材料的采集時期，由于植物細胞中酶的活性較低，褐變現象的發生幾率也會隨之減小。

2.2 植物處理方式的影響

在正式進行植物組織的培養之前，相關人員還需對植物體進行水培、消毒等預處理手段，也會對植物后續的褐變幾率產生影響。通常來講，植物的水培時間越長，其褐變幾率越低。同時，先采用流動水沖洗植物，再進行5℃左右的低溫處理，從而降低植物細胞的活性，也能達到降低褐變幾率的預處理效果。此外，相關人員在對植物材料進行消毒時，也應遵循科學適度的處理原則。一方面，氯化汞對植物體的傷害較輕，褐變幾率也較低；乙醇的滅菌效果較強，但對植物體的傷害較大，褐變現象也較容易發生。因此，相關人員應結合具體的培養需求，實施出正確的消毒劑選擇策略。另一方面，植物的消毒時間越長，其褐變的發生幾率也越高。所以，相關人員還應對消毒處理的時間進行合理控制，以確保植物的健康生長。

2.3 植物培養環境的影響

培養基作為植物培養生長的重要基礎，其基質種類、營養成分的不同也會對植物褐變現象產生差異影響。當培養基中的無機鹽濃度過高時，植物體內的酚類底物會從細胞間質中溢出，繼而與酶充分接觸，引發褐變現象。因此，通過降低培養基中亞鐵離子、亞銅離子等離子的濃度，能有效防止酚類底物的外溢，避免酚類底物與酶接觸發生氧化，從而將褐變現象的發生幾率控制在較低水平。同時，不同植物種類對培養基的適應能力也各不相同。經研究顯示，核桃、櫻花、蘋果等植物在1/2MS與1/2DKW兩種培養基中的褐變控制效果最好，銀杏、紅豆杉等植物在MS培養基中的褐變控制效果最好。

其次，在植物組織培養的過程中，做好基質的選擇也是極有必要的。從褐變現象的預防角度來看，紙橋法為最佳，液體培養法次之，半固體培養法再次，固體基質的預防效果最差。究其原因，主要是紙橋法的濾紙結構可實現毒害物質的滲透吸取，進而達到清潔培養環境、減輕褐變危害的效果；液體基質可實現毒害物質的外化擴散，從而緩解褐變現象的集中形成，也能達成較好的褐變減輕目的；半固體基質多以低濃度的瓊脂為主，其雖然也能保有類似液體基質的毒害物質擴散能力，但由于動性較差，褐變減輕效果并不理想；固體基質則無法完成毒害物質由植物體向外部環境的有效導出，因此很難對褐變現象起到控制作用。

最后，上文提到，季節變化可對植物體內酶的活性產生影響，控制植物組織培養環境的溫度也可達到此類效果。一般來說，溫度處在較低水平時，褐變現象能得到顯著減輕。例如，當板栗的培育溫度降至19℃時，其褐變程度明顯緩解；當無花果的培育溫度降至10℃時，其褐變幾率最低。因此，相關人員在不影響植物健康生長的基礎上，可進行培養環境溫度的適當調低。與之相似，經桉樹外植體全光照與無光照的比對培養試驗發現，10個試驗日內全光照下的桉樹褐變幾率明顯增高，而無光照下的桉樹則正相反。由此可見，通過調節光照條件、適當抑制植物的光合作用，也能起到減緩植物代謝、降低褐變幾率的效果。因此，相關人員在植物組織培養的實踐當中，也可適當應用暗處理的褐變預防手段。

3 植物組織培養中褐變現象的克服方法

3.1 做好植物材料的科學選擇

上文提到，植物材料的成長狀態、采集時間都會對褐變現象的發生幾率產生影響。因此，相關人員在選擇和采集外植體進行植物組織培養時，應盡量選擇幼齡期的植株，并將采集時間避開夏季。同時，基于自然生長規律，植物在冬天往往處在深度休眠當中，生長能力較弱，故而存在較大的采集難度。所以，在早春或深秋進行外植體采集為宜。除此之外，由于同一類型下不同品種植物的褐變程度也有所差異，因此相關人員在采集時還應注意植物的基因特點，選擇出褐變程度較小、褐變幾率較低的植物品種作為外植體。

3.2 實施合理的植物預處理手段

酶與酚類底物在氧的催化作用下生成醌，這類物質是植物體發生褐變現象的毒害元兇。在進行植物組織培養的過程中，相關人員可通過科學的預處理手法，降低醌類物質的毒害作用與生成能力。首先，應將外植體進行流水沖洗，再將其置于2℃至5℃的環境中低溫處理12小時至24小時，從而減緩植物的代謝，降低細胞內酶的活性。其后，再應用氯化汞或70%濃度的乙醇對外植體進行消毒，將其接種在僅含蔗糖的半固體培養基中培養5天至7天，以便將植物組織中的酚類底物滲透到瓊脂當中。若一周后仍有酚類底物滲出，則還需進行2至3次培養基轉移。最后，當酚類物質顯著減少時，便可將外植體接種到適宜的培養基當中。這樣一來，在促進外植體切口愈合的同時，能達到理想的褐變現象減輕目的[2]。

3.3 優化植物培養的環境條件

首先，應基于植物組織培養的技術條件，按照紙橋培養、液體培養、半固體培養、固體培養的次序選擇培養基質，并結合外植體品種對培養基的MS、WPM、B5等具體類型進行科學選擇，控制好培養基中蔗糖、無機鹽、離子的成分濃度。其次，由于溫度會對植物的褐變程度與褐變幾率產生影響，所以相關人員應保證培養環境溫度不宜過高。最后，在外植體的培養初期，可在無光照或弱光照的暗處理條件下進行，以便降低植物細胞中酶的活性，有效規避褐變現象的產生。

3.4 在培養基質中適當添加抗褐變劑

當合理實施上述措施后，仍然無法達成高水平的褐變現象客服效果時，相關人員而通過添加抗褐變劑的方式，對植物組織培養條件進行人工改良。從當前來看，業內常用的抗褐變劑主要有吸附劑、抗氧化劑兩類。其中，吸附劑主要以活性炭為主，可在氫鍵與分子的相互作用下實現周圍物質的有效吸附。但需要注意的是，由于活性炭的吸附缺乏選擇性，其在吸附毒害物質的同時，也會吸附培養基中的營養成分，進而與外植體形成一定的競爭效應。對此，相關人員在應用活性炭時，可適當提高培養基內營養物質的濃度，以便保證植株的健康生長。據有關研究顯示，在應用活性炭后，植物褐變現象的產生幾率可降低22%左右。抗氧化劑有檸檬酸、硝酸銀、植酸、二硫蘇糖醇等多種類型，可對植物細胞內酚類底物的氧化效應形成抑制作用，從而降低醌類毒害物質的生成，達到阻抗褐變現象的效果。需要注意的是，不同類型、不同濃度的氧化劑對不同植物材料的作用能力也存在一定差異。例如，對于葡萄的愈傷組織來說，濃度為20克每升的甘露醇溶液應用效果最好，濃度為0.02克每升的硝酸銀溶液次之；對于牡丹來說，濃度為2.0毫克每升的硝酸銀溶液應用效果最好。

4 總結

總而言之，結合業內研究成果與實踐經驗發現，植物褐變現象產生的影響因素比較多樣復雜。因此，相關人員在植物組織培養的過程中，也應從植物品種、培養環境、預處理等多個角度入手進行優化，以便實現植物褐變幾率的有效降低。