VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌研究進展

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(1.四川大學華西醫院超聲科，2.臨床超聲影像藥物研究室，四川 成都 610041)

目前,我國乳腺癌發病率的增長速度居全球首位，已成為城市女性最常發生的惡性腫瘤之一。超聲分子顯像(ultrasound molecular imaging, USMI)通過靶向超聲造影劑識別病變血管內皮細胞特異性表達靶點[1]，實現在分子水平診斷疾病。靶向超聲造影劑的靶點主要為炎癥病灶、血栓、新生血管等部位的特定生物標記物[2-3]。新生血管在惡性腫瘤發生及轉移中有重要角色，而血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)/血管內皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)通路是腫瘤新生血管的重要調控通路。VEGFR2是VEGF/VEGFR通路的重要因子，參與調節乳腺癌新生血管微循環滲透性及內皮細胞增殖、遷移和侵襲等[4]。本研究對VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌的研究進展進行綜述。

1 靶向超聲造影的作用原理

超聲造影由微泡振蕩產生非線性聲增強超聲信號，通過特定脈沖序列包括諧波濾波器、脈沖反向、波幅調制等區分微泡信號與周圍組織及血流信號。超聲造影劑是由脂質、白蛋白或多聚物等包裹惰性氣體形成的微泡[5]，直徑小于10 μm，可自由通過毛細血管，且不會滲出血管，從而將不同疾病的靶向生物標記物連接于微泡表面[6]。在診斷疾病過程中，靶向超聲造影劑可與血管內皮靶點特異結合，以超聲信號強度的變化反映靶點分子表達水平[7-8]，進而反映局部組織微血管循環。

靶向超聲造影需在超聲造影產生增強超聲信號的基礎上進一步區分結合微泡與非結合微泡產生的聲信號。目前主要通過超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)延長聲信號采集時間，以區分結合微泡與非結合微泡產生的聲信號，即隨著采集時間延長，自由流動的非結合微泡被從目標區域清除；隨后采用高機械指數破壞聲場區的結合微泡，計算破壞前后靶向聲信號差(differential targeted enhancement, dTE)，以dTE值表示結合微泡產生的聲信號強度[9]。

2 VEGFR2靶向超聲造影用于乳腺癌診斷的原理

在乳腺纖維腺瘤、導管內原位癌及浸潤性乳腺癌等組織中均存在VEGFR2表達。VEGFR2表達水平變化與腫瘤病理分期、轉移及預后等密切相關[10]。既往研究[11]表明，檢測腫瘤新生血管內皮細胞VEGFR2表達水平可用于區分乳腺纖維腺瘤與惡性腫瘤，且診斷準確率高于αVβ3整合素及局部血管密度計數。局部血管密度計數只納入CD31陽性血管，計數的血管數量接近具有灌注功能的血管數，即常規超聲造影產生聲信號的血管數，提示常規超聲造影對區分浸潤性乳腺癌與乳腺纖維腺瘤及導管內原位癌的應用價值較低[12]。VEGFR2靶向超聲造影劑可與病灶血管內皮細胞VEGF特異結合，并滯留于血管內皮細胞，增強靶區超聲回波信號。VEGF2靶向超聲造影以非侵入性方法定量分析新生血管分子標記物VEGFR2表達，可從分子水平反映腫瘤新生血管增生情況[13]。

3 VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌的實驗研究及臨床研究

3.1 細胞實驗 細胞實驗可直觀反映VEGFR2靶向超聲造影劑與單一細胞間的結合情況及特異性識別靶點能力。在VEGFR2靶向超聲造影細胞實驗中，主要選擇人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVEC)、小鼠SVR血管肉瘤細胞等VEGFR2高表達細胞，同時選取小鼠乳腺癌4T1細胞等不表達VEGFR2的細胞作為對照，以檢測靶向微泡對VEGFR2的識別能力。VEGFR2靶向超聲造影劑與其高表達細胞具有良好的結合力，且結合力與VEGFR2表達水平相關[14]。Pochon等[15]發現VEGFR2靶向超聲造影劑可與HUVEC結合，采用足量VEGFR2單克隆抗體對HUVEC進行預飽和，再加入VEGFR2靶向超聲造影劑，結果顯示造影劑與HUVEC未結合，表明VEGFR2靶向超聲造影劑具有特異性識別VEGFR2的能力。Willmann等[16]采用VEGFR2及αVβ3整合素雙靶點靶向超聲造影劑對小鼠SVR細胞和4T1細胞進行研究，證實雙靶點靶向超聲造影劑可與SVR細胞特異性結合，且結合力顯著高于4T1細胞；同時雙靶點靶向超聲造影劑與SVR細胞的結合力顯著高于單靶點造影劑，提示存在VEGFR2及其他靶點的靶向超聲造影劑與靶向微泡的結合力增加。

3.2 動物實驗 Lee等[17]對67NR乳腺癌細胞小鼠移植瘤模型的研究表明，VEGFR2靶向超聲造影劑在腫瘤內的滯留時間顯著高于非靶向微泡；定量分析發現，腫瘤血管內皮細胞VEGFR2靶向超聲造影劑滯留產生的聲信號強度與VEGFR2表達水平具有相關性，非靶向微泡滯留產生的聲信號強度低且與VEGFR2表達水平無關。Pochon等[15]在大鼠乳腺脂肪墊下種植13762 MAT B Ⅲ CRL-1666大鼠乳腺癌細胞8天后，VEGFR2靶向超聲造影檢查發現直徑約5～8 mm的乳腺腫塊。Bzyl等[18]對MCF-7人源性乳腺癌小鼠模型的研究發現，VEGFR2靶向超聲造影產生的聲信號dTE值可鑒別直徑約2 mm的乳腺癌與正常乳腺腺體；隨著腫瘤體積的增加，VEGFR2靶向超聲造影產生的聲信號強度下降，但仍較非靶向微泡聲信號強度高；VEGFR2免疫組織化學結果證實隨著腫瘤體積增大，VEGFR2表達水平下降，考慮可能與腫瘤成熟血管增多相關。Warram等[19]對人乳腺癌MDA-MB-231細胞小鼠移植瘤模型的研究發現，三靶點靶向超聲造影劑產生的聲信號強度高于雙靶點及單靶點造影劑；提示聯合使用多種針對腫瘤新生血管內皮細胞的特異性靶向標記物，能夠增加靶向超聲造影劑在腫瘤新生血管內皮細胞產生的聲信號強度，進一步提高診斷準確性。

抗血管生成是治療乳腺癌的重要手段，但其療效存在較大個體差異。VEGFR2靶向超聲造影作為一種早期監測VEGFR2表達水平的無創方法，可通過觀察血管生成情況反映抗血管生成治療效果，亦可通過評估VEGFR2表達程度評價不同抗血管生成藥物對VEGFR2靶點的作用效果，有助于為乳腺癌制定個體化臨床治療方案。Zafarnia等[20]對小鼠MCF-7乳腺癌模型的研究表明，癌細胞對尼羅替尼(抑制血管成熟)治療可出現短暫應答，但隨后腫瘤體積增大、dTE值增加，VEGFR2表達水平升高，導致疾病進展；提示VEGFR2靶向超聲造影可用于評估尼羅替尼抗血管治療效果，可能為闡明尼羅替尼耐藥機制提供依據。

4 VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌的臨床研究

生物素-親和素連接法是制備靶向超聲造影劑最具代表性的方法，但人體易對親和素產生嚴重的免疫反應。BR55是獲批應用于臨床的磷脂類VEGFR2靶向超聲造影劑，其使用多聚短肽作為連接體，避免了親和素導致的免疫反應。目前已完成的BR55Ⅱ期臨床試驗[21]結果顯示，93%乳腺癌患者VEGFR2表達水平與dTE值具有一致性，乳腺癌區域超聲滯留聲信號強度為周圍正常乳腺組織的8倍，且患者均未出現嚴重不良反應。

5 問題與展望

研究靶向超聲造影有利于無創分子診斷技術的發展，并能提高乳腺腫瘤超聲診斷準確率。雖然VEGFR2靶向超聲造影對于乳腺癌診斷及預后評估的研究已取得初步進展，但該技術仍需改進和完善：①規范定量分析標準，比較不同研究結果之間的一致性；②提高VEGFR2靶向微泡在體內循環的時間及穩定性，增加微泡延遲成像信號強度；③增加微泡與目標靶點的結合力，微泡與腫瘤的多靶點結合以增加靶向微泡的特異性；④探索其對乳腺癌淋巴結轉移的診斷價值。

VEGFR2靶向超聲造影時，需對超聲造影圖像進行定量分析，以區分表達VEGFR2的良性和惡性腫瘤，包括計算各種灌注參數和閾值等。VEGFR2靶向超聲造影用于診斷乳腺癌或療效評估時，可考慮將其與3D成像、超聲探頭自動掃描成像及計算機輔助檢測等技術相結合，以減少對操作者的依賴性，提高診斷準確性和臨床可操作性。此外，保證VEGFR2靶向超聲造影圖像與免疫組化分析方面的一致性，也是推動其走向臨床的關鍵。