脂肪干細胞通過旁分泌作用改善異種脫細胞真皮基質體內植入效果的機制研究

朱朱 袁兆琪 黃成 楊軍 羅旭松

脫細胞真皮基質（ADM）是一種具有良好生物相容性及生物力學性能的天然來源材料，臨床上常用于乳房重建或與自體皮片聯合使用以修復深度創面[1-3]。由于異體脫細胞真皮基質來源短缺且價格昂貴，而異種（豬）脫細胞真皮基質（HPADM）與人來源ADM（hADM）在組織學上具有高度相似性，是代替hADM的合適材料[4]。但是，ADM類材料結構過于致密，植入人體后難以快速、充分地細胞化及血管化，導致其臨床應用受到一定限制[5]。此外，盡管去除了免疫原性的細胞成分，異種ADM植入人體后仍表現出一定的慢性炎癥反應[6]，這是HADM臨床應用的兩大限制因素。

脂肪干細胞（ADSCs）是組織工程研究中廣泛應用的種子細胞[7]，其旁分泌作用能產生一系列的促血管形成及炎癥調節因子[8-9]。由于不同的支架材料能形成各自獨特的生物微環境，并能通過細胞-材料間的相互作用而改變在其中生長的種子細胞的生物學行為[10-11]。因此，我們嘗試探索HADM能否為ADSCs發揮其旁分泌功能提供合適的、有益的微環境，并探討ADSCs體外預培養對HADM植入人體后的血管化及炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Fisher 344雄性大鼠 （本院動物實驗中心）；HADM（江蘇優創生物醫學科技有限公司）；引物（上海生物工程股份有限公司）；CCK-8試劑盒 （Dojindo，日本）；qRT-PCR 試劑盒（Applied Biosystems，美國）；ADSCs誘導分化試劑盒（Cyagen，美國）。

動物實驗經過本院倫理委員會批準，審批號：HKDL[2018]214。

1.2 實驗方法

1.2.1 HADM性質檢測

大體觀察：用數碼相機在同一高度、相同比例尺下對HADM進行拍攝，顯示其大體形態。

電鏡檢測：將HADM放置于2.5%戊二醛中固定，后轉至1%的鋨酸中固定；固定后的材料置于梯度乙醇脫水，臨界點干燥，掃描電鏡觀察并拍攝。

組織學染色：HADM多聚甲醛固定，乙醇干燥脫水，包埋，5 μm厚度切片，HE染色。

1.2.2 ADSCs獲取、培養及鑒定

從大鼠兩側腹股溝獲取脂肪組織，酶消化法獲取原代ADSCs，以含10%胎牛血清的低糖DMEM在37℃、5%CO2下培養，0.05%胰酶消化換代。

取第2代 ADSCs，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，按照ADSCs誘導分化試劑盒說明書進行誘導分化，茜素紅染色檢測成骨分化能力、油紅O染色檢測成脂分化能力。

1.2.3 細胞材料相容性檢測

電鏡觀察：將材料裁成24孔板大小（約1.9 cm2），消毒后置于24孔板內，按1×105個/孔的密度接種ADSCs，48 h后進行電鏡觀察。

浸提液檢測材料毒性：材料置于24孔板中，1 mL DMEM（含10%胎牛血清）浸沒72 h，收集上清液并過濾。將ADSCs以2×104個/孔的密度接種于96孔板中，分別用浸提液及普通完全培養基 （低糖DMEM+10%胎牛血清）培養 7 d，于第 1、3、5、7 天加入CCK-8試劑，培養箱孵育2.5 h后于450 nm處行吸光度檢測。

1.2.4 ADSCs在不同培養條件下的旁分泌因子表達情況

將ADSCs以1×105個/孔的密度接種于24孔板或相應大小的HADM上培養48 h，用Trizol提取全部細胞中的RNA，并用qRT-PCR法檢測ADSCs在不同培養條件下的促血管形成因子（VEGF、HGF、bFGF）、炎癥調節因子（TGF-β、iNOS、TSG-6、COX-2）及干性基因（SOX-2）的表達情況（表 1）。

1.2.5 ADSCs體外預培養對HADM植入后的血管化及炎癥反應的影響

將 ADSCs以 5×104cells/cm2的密度接種于HADM 上（2 cm×2 cm 大小），DMEM+10%胎牛血清培養1周后備用。

在大鼠背部形成一2 cm×2 cm大小的U型皮瓣，掀開皮瓣，將HADM縫合到底部筋膜上并關閉切口。實驗組移植經ADSCs體外預處理的HADM，對照組則移植未經處理的HADM。術后4周取材，將樣本與周圍組織一同取出，固定后行組織學檢測。1.2.6 統計學分析

以GraphPad7軟件分析數據，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HADM大體形態、電鏡及組織學形態

HADM呈瓷白色，柔軟且有一定彈性，厚度大約0.15 mm。電鏡顯示其粗糙面有絨毛樣外觀而光滑面則有溝壑。HE染色顯示HADM中無細胞、皮膚附屬器等成分，真皮基質大部分由膠原組成（圖1）。

2.2 ADSCs的培養鑒定及HADM的毒性檢測

ADSCs呈長梭形，原代細胞培養3～4 d可形成集落，約1周后可傳代。成骨誘導28 d后，茜素紅染色可見散在的紅色結節；而成脂誘導21 d后油紅O染色可見紅染的脂滴（圖2a-c）。

電鏡觀察顯示，ADSCs在HADM上培養48 h后細胞黏附良好，細胞可從材料上伸出類似偽足的結構，證明細胞能夠完全鋪展。CCK-8結果顯示，HADM浸提液培養的ADSCs在第1和第7天時的細胞增殖情況，與完全培養基培養的ADSCs沒有統計學差異，說明HADM無明顯細胞毒性；而第 3和第5天時的增殖速度略慢于完全培養基 （P＜0.05），這可能是由于HADM的浸提液中含有能夠維持ADSCs干性的成分，使得其增殖略慢（圖2d-f）。

2.3 ADSCs在不同培養條件下的旁分泌因子表達

qRT-PCR檢測結果表明，在HADM微環境下培養的ADSCs與在普通培養皿上培養的ADSCs相比，其促血管生成因子、炎癥調節因子以及干性因子等均有所上調，且結果有統計學差異（P＜0.05）。

其中，參與多條炎癥通路調節的TGF-β上調了2.26倍；編碼PGE2蛋白這一重要巨噬細胞炎癥反應的因子COX-2上調了3.6倍；抗炎因子TSG-6則上調了4倍；與ADSCs活化相關的炎癥因子iNOS上調了2.14倍，而干性因子SOX-2則提高了6.7倍。VEGF、HGF和bFGF是三個重要的促血管形成因子，在血管形成的3種方式，即血管發生（Vasculogenesis）、血管新生（Angiogenesis）及動脈形成（Arteriogenesis）中均有重要作用，而ADSCs這三種因子表達在HADM上培養時比在普通培養皿上培養時分別升高了2.7倍、1.9倍和8倍（圖3）。

圖1HADM性質Fig.1 Characterization of HADM

2.4 ADSCs體外預培養對HADM植入體內后的血管化及炎癥反應的影響

組織學顯示，經預培養的HADM在體內4周后可見大量新生血管形成，且宿主細胞能夠均勻滲透到材料內部；而未經處理的HADM中新生血管明顯較少，且主要分布在材料周邊。宿主炎癥反應方面，經過預處理的HADM炎癥反應較輕微，且主要集中于材料外周；而未經處理的HADM炎癥反應明顯更強，炎癥細胞在材料的中間及周圍廣泛分布。上述結果提示，ADSCs體外預培養能夠促進移植物植入體內后的新生血管形成，并緩解其炎癥反應（圖4）。

圖2 ADSCs形態、多向分化潛能及HADM細胞毒性Fig.2 Morphology and multilineage differentiation potential of ADSCs and cytocompatibility of HADM

圖3 HADM微環境對rADSC旁分泌功能相關基因的影響（*：P＜0.05）Fig.3 Effect of HADM microenvironmenton on the rADSC paracrine related gene expression(*:P＜0.05)

圖4 體內培養4周后各組HADM組織學觀察Fig.4 Histological analysis of HADM in each group after cultured for 4 weeks in vivo

3 討論

在前期的軟骨構建研究中我們發現，移植物的炎癥反應可能是影響組織工程構建結果的重要因素。將軟骨細胞與支架材料體外預培養后，軟骨細胞能夠分泌細胞外基質，包裹支架材料以隔絕材料與宿主組織的直接接觸，從而能夠顯著提升構建軟骨的質量[12]。雖然HADM去除了免疫原性的細胞成分，大大降低了其植入體內后的宿主免疫反應，但仍有不少報道稱HADM仍能引起慢性炎癥反應，從而影響HADM植入體內后的效果[13-14]。因此，我們設想能否通過將ADSCs與HADM體外預培養來解決以上問題。本研究結果顯示，經ADSCs預培養的HADM植入體內后，其炎癥反應較對照組明顯降低。其機制不同于軟骨細胞這類成體細胞，ADSCs并不能分泌可觀的細胞外基質，并且大量研究認為，由于移植后復雜的宿主反應，ADSCs的多向分化能力與其治療性作用的關系也不大，而ADSCs的旁分泌產物則有可能在此過程中起到關鍵作用[15]。ADSCs能夠分泌包括促血管形成的VEGF、HGF[16]，調節炎癥反應的TGF-β、TSG-6等眾多營養因子[17]，在促進血管形成、炎癥調節、抗凋亡、抗瘢痕形成以及調節宿主自身的祖細胞、干細胞方面有重要作用。有研究報道，ADSCs能夠改善支架材料植入體內后的生物相容性及血管形成[18]，亦與本研究結果一致。

近期的研究顯示，支架材料由于其拓撲結構、力學性能、化學性質等的差異，能夠形成特殊的微環境，通過細胞-材料的相互作用對細胞行為產生影響[19-20]。然而，HADM能否為ADSCs旁分泌功能提供合適的微環境，目前尚未有文獻報道。本研究首次證明，HADM所產生的微環境能夠提高炎癥調節因子（TGF-β、iNOS、TSG-6、COX-2）、 促血管形成因子（VEGF、HGF、bFGF）表達上調。 有研究提出，使用聚已酸內酯（PCL）材料證明，PCL來源的電紡絲材料能夠對ADSCs的旁分泌功能產生促進作用，亦與本研究結果一致[21]。但不同的是，本研究中，ADSCs在HADM環境中培養時，iNOS這一促炎因子的水平亦明顯降低。這可能是由于電紡絲材料制備過程當中的毒性物質殘留，或者PCL材料降解時產生酸性物質。作為一種天然來源的材料，HADM在這一方面有明顯的優勢。

本研究證實，將ADSCs與HADM體外預培養能夠促進HADM植入體內后的血管形成，并緩解其炎癥反應。其可能的機制在于ADSCs旁分泌所產生的營養因子，可促進了新生血管的形成，并調節炎癥反應的強度。此外，我們還證明了HADM所產生的微環境能夠強化ADSCs的旁分泌作用。今后，我們將進一步優化HADM，從而為其更廣泛的應用于臨床奠定基礎。