腎缺血再灌注通過促凋亡途徑加重糖尿病小鼠腎損傷

韓慶玲, 鄭德義, 李偉人, 王志偉, 杜 嬌, 王 毅

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，糖尿病時長期存在的高血糖，導致各種組織損傷，特別是腎、心臟、血管和神經等多器官組織的慢性損害及功能障礙[1]。實驗研究[2-3]顯示糖尿病會加重器官對缺血的損傷，降低器官缺血的預后。腎臟是機體維持內環境穩定的重要器官，臨床上不同病因如麻醉、手術或移植等引起循環休克都可以導致腎缺血再灌注損傷，腎缺血再灌注是急性腎功能衰竭的病因之一[4]。但是，在糖尿病的病理基礎上，遭受以上病變所致的急性腎功能損傷及其發病機制尚不完全清楚。該實驗從凋亡方面探索腎缺血再灌注加重糖尿病腎損傷的機制，為臨床研究糖尿病合并腎缺血再灌注損傷病理生理機制及防治措施提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑及儀器鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司；無創微動脈夾購自北京中科恒天科技有限公司；抗體Bcl-2、Bax、β-actin購自英國Abcam公司；抗體Caspase-3購自美國Millipor公司;RIPA裂解緩沖液、ECL顯色液購自上海碧云天生物技術研究所;GelDoc XR System凝膠成像系統購自美國BIO-RAD公司。

1.2實驗分組及模型建立清潔級雄性C57BL/6J小鼠，18～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(SCXK 2014-0004)。28只C57 BL/6J小鼠隨機分為正常血糖假手術組(Sham組)6只，糖尿病假手術組(DM+Sham組)6只，正常血糖腎缺血組(I/R組)8只，糖尿病腎缺血組(DM+I/R組)8只。小鼠飼養在清潔、通風良好的環境中，自由飲食水，12 h晝夜節律。

1.3糖尿病及腎缺血再灌注損傷模型建立參考文獻[5]建立1型糖尿病小鼠模型，小鼠禁食不禁水12 h后，將鏈脲佐菌素以0.5%的濃度溶于0.1 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)，以55 mg/kg連續5 d腹腔注射，自由進食水，觀察72 h后，用血糖儀檢測鼠尾靜脈血糖濃度，血糖濃度>16.7 mmol/L，小鼠出現多尿，體重下降表現，表示糖尿病模型成功。繼續喂養糖尿病小鼠4周后，建立腎缺血再灌損傷模型：小鼠腹腔注射3.6%(10 ml/kg)水合氯醛麻醉后，脫去腹部毛發，碘伏常規消毒后，沿腹正中做大約2.5手術切口，找到并分離左右腎動靜脈，用無創微血管夾夾閉，腎臟由鮮紅色變為暗紫色，30 min后，松開微血管夾恢復血流灌注，腎臟迅速恢復正常顏色，假手術組只分離腎動靜脈不夾閉，逐層關閉腹腔。整個手術過程中，小鼠都放置在加熱毯上以保持體溫恒定在(37±0.5)℃，術區以生理鹽水濕紗布覆蓋。

1.4實驗方法

1.4.1腎功能檢測 按照試劑盒說明書取血清，采用貴州省人民醫院檢驗科全自動生化分析儀 (日本日立公司)進行血清尿素氮與肌酐的檢測。

1.4.2Western blot 檢測腎組織凋亡蛋白的表達 取腎組織，加入RIPA裂解緩沖液用組織研磨器研磨勻漿后，提取腎臟總蛋白并定量變性。取10 μl總蛋白加入預制好的15%聚丙烯酰胺凝膠中，先用80 V電壓分離30 min，然后再調至120 V分離1.5 h。半干轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(16 V，16 min)。室溫下5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后用含有目的蛋白抗體的一抗稀釋液孵育(Bax，兔抗，1 ∶500稀釋；Bcl-2，兔抗，1 ∶500稀釋；Caspase-3，兔抗，1 ∶200稀釋；β-actin，鼠抗，1 ∶200稀釋)于4 ℃冰箱搖床上孵育過夜。TPS漂洗3次，每次10 min，后用含辣根過氧化物酶標記的相應二抗(1 ∶1 000稀釋)稀釋液室溫下孵育1 h。再次經TPS洗滌3次，每次10 min，加入ECL顯色液用GelDoc XR System凝膠成像系統檢測。以β-actin表達水平作為內參，應用Image J進行條帶分析，目的蛋白的表達量以目的蛋白與內參照蛋白平均光密度的比值表示。

2 結果

2.1各組小鼠血糖、體重、血清肌酐、尿素氮情況腎臟缺血再灌注術前，測小鼠空腹血糖和體重，Sham組與I/R組比較無明顯差異；分別與Sham組及I/R組比較，DM+Sham組和DM+I/R組小鼠血糖明顯升高、體重顯著減輕(P<0.05)。通過檢測各組血清肌酐、尿素氮顯示，與Sham組比較，DM+Sham組、I/R組及DM+I/R血清肌酐、尿素氮升高(P<0.05)，表明糖尿病及腎缺血再灌注導致腎功能損害，但DM+I/R表現更嚴重的腎功能損害。與DM+Sham組比較，DM+I/R組血肌酐、尿素氮明顯增高(P<0.05)，說明腎I/R加重腎功能損害。見表1。

2.3Westernblot檢測凋亡蛋白在各組小鼠模型腎組織中的表達Western blot檢測各組小鼠腎組織Bax 、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達，結果顯示:與Sham組比較，DM+Sham組和I/R組Bax和Caspase-3的蛋白表達水平升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)；與DM+Sham組和I/R組比較，DM+I/R組小鼠腎組織中Bax和Caspase-3蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖1。

3 討論

糖尿病發病率持續增高趨勢，根據國際糖尿病聯盟(IDF)最新報告，2017年全球約4.25億成人患糖尿病，預計到2045年，糖尿病患者可能達到6.29億[6]。隨著糖尿病病程的延長，可伴發多器官功能障礙，其中糖尿病腎病為糖尿病引起的微血管并發癥，是引起終晚期腎病的首要原因[7]。腎臟是能量需求大、微循環豐富的器官，對缺血再灌注損傷極為敏感[8]，腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷最常見的原因之一，臨床上主要繼發于低血容量休克、心血管外科手術及腎移植等[9]。目前針對糖尿病腎損傷報道較多，但糖尿病腎急性缺血再灌注損傷國內外尚少報道。所以糖尿病腎缺血再灌注損傷值得引起重視。目前研究[10]表明，腎臟缺血再灌注損傷的機制可能與內質網應激，氧化應激，炎癥，內皮功能障礙等有關。但是，腎缺血再灌注加重糖尿病腎損傷的發生機制尚不清楚。

表1 4組小鼠術前空腹血糖、體重及術后腎功能情況比較

與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05;與DM+Sham組比較：▽P<0.05

圖1 凋亡相關蛋白在各組小鼠腎組織中表達

A：Bax；B：Bcl-2；C：Caspase-3；與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05;與DM+Sham組比較：▽P<0.05

本實驗通過腹腔連續注射低劑量鏈脲佐菌素制作糖尿病動物模型，建模成功后觀察4周，檢測小鼠空腹血糖及體重，結果顯示糖尿病小鼠空腹血糖明顯高于正常血糖小鼠，而糖尿病小鼠空腹體重卻明顯低于正常血糖小鼠，說明糖尿病模型成功建立。本實驗采取夾閉雙側腎動脈30 min，再灌注12 h造腎缺血再灌注模型，顯示缺血小鼠血清肌酐尿素氮明顯高于假手術組，且糖尿病缺血組小鼠血清肌酐尿素氮明顯高于正常血糖缺血組，說明腎缺血模型建立成功，且腎缺血加重了糖尿病腎功能的損傷。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，受多種基因精確調控的主動的、程序化的死亡過程，是機體重要穩態的重要調控機制[11]。調控細胞凋亡的Bcl-2家族在細胞凋亡轉導通路中發揮了極為重要的調控作用[12]。Bcl-2家族中，Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因。Caspase家族是細胞凋亡過程中發揮關鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其中的Caspase-3是最重要的細胞凋亡效應蛋白酶之一，是凋亡的執行者[13]。Bcl-2可以抑制細胞色素C從線粒體釋放到細胞質從而抑制細胞凋亡的發生。而Bax可以通過與Bcl-2形成二聚體而抑制Bcl-2的表達及活性[14]。Bcl-2與Bax是一個平衡體系，Bax表達過度，則Bcl-2表達下調可活化Caspase-3，從而促進細胞凋亡，反之則抑制細胞凋亡[15]。本實驗結果顯示，凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3在正常血糖缺血組和糖尿病假手術組升高，在糖尿病缺血組升高更明顯，而Bcl-2在正常血糖缺血組和糖尿病假手術組降低，在糖尿病缺血組降低更明顯。本實驗結果表明凋亡參與了糖尿病加重腎缺血再灌注損傷，凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的變化起調控作用。目前本實驗只是初步探測了糖尿病腎缺血中凋亡相關蛋白的表達變化，關于其上下游的調控機制和三者之間的相互關系還需進一步探索。