安菲博肽保護小鼠缺血性腦損傷的抗血小板活化機制

許哲昊，后世翔，陳春燕，秦志強，王 坤，章 成，周蘭蘭

缺血性腦病是世界范圍各個人群中都存在的一種疾病，也是臨床上最為常見的能夠引起患者死亡的疾病，其發病后死亡率和致殘率很高，這些均是缺血性腦病的顯著特點，除此之外，缺血性腦病能夠對患者的生命安全造成極其嚴重的危害，并給社會及患者家庭帶來沉重的醫療負擔。因此，深入了解其發病機制，進行藥物干預極為重要[1-2]。

安菲博肽(anfibatide，ANF)是一種多肽，上世紀90年代初從蛇毒中提取分離，具有顯著的抗血小板黏附、聚集的效果，ANF作為血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib的受體阻斷劑，是世界上第一種以GPIb為靶點的抗血栓的藥物。前期研究[3]顯示ANF可以顯著降低缺血性腦損傷小鼠的腦梗死體積且具有保護大腦的功能，該文在前期研究基礎上觀察ANF對小鼠缺血性腦損傷保護作用及其抗血小板活化作用機制，為ANF進一步應用提供依據。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器ANF購自合肥兆科藥業有限公司，生理鹽水配置，現配現用，批號：20150924；鹽酸替羅非班氯化鈉注射液購自武漢遠大制藥集團，5 mg/100 ml，批號：151008；鼠抗vWF單克隆抗體購自美國SANTA公司，批號：T7505；兔抗GPIba多克隆抗體購自英國biorbyt公司，批號：A2319；CY3山羊抗鼠LgG購自北京博奧森生物技術有限公司，批號：990796；FITC標記山羊抗兔LgG、免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：122319A、13152A06；小鼠P選擇素、β-TG ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司，批號：E202012M、E92163M；DMI-6000型激光共聚焦熒光顯微鏡、RM2135 型石蠟切片機購自德國Leica公司；BM-Ⅱ型病理組織包埋機、QP-B1 型切片漂烘溫控儀購自安徽電子科學研究所。

1.2小鼠短暫性大腦中動脈閉塞(transientmiddlecerebralarteryocclusion，tMCAO)致局灶性腦缺血模型制備及分組給藥雄性昆明種小鼠50只、SPF級、6～8周、體質量18～22克，隨機分為5組。使用改良 Zea Longa法[4]制備小鼠短暫性大腦中動脈閉塞模型。腹腔注射濃度為7%的水合氯醛(350 mg/ kg)使小鼠麻醉，待小鼠癱軟翻正反射消失后將小鼠固定于鼠板，之后在頸部正中處做一縱向切口，大約為1 cm左右。然后緩慢將小鼠右側頸總動脈、頸內和頸外動脈從肌肉組織中鈍性分離，使其暴露在視野下，之后用3-0手術線結扎頸總和頸外動脈，在頸內和頸外動脈分叉處剪一小口，使用的線栓為細尼龍線(?0.128或0.148 mm)，插入頭端用蠟灼圓并蘸取多聚賴氨酸，尼龍線插入頸內動脈長度距分叉處約9～10 mm，結扎絲線。在小鼠頸部切口處滴加少量抗生素，然后縫合切口，最后進行消毒皮膚。待小鼠缺血90 min后拔出絲線，從而使血流再灌。手術過程使用保溫毯維持小鼠體溫在37 ℃ 左右，假手術組小鼠不做血管結扎和阻塞外，其余均與各組相同，整個實驗時間控制在15 min內為宜。雄性昆明鼠，分為假手術組(Sham)、模型組、ANF組(4、2和1 μg/kg)和陽性藥替羅非班(TRF)組(0.5 mg/kg)。各用藥組分別于缺血90 min再灌注1 h后給藥，注射量為10 ml/kg。

1.3ELISA法檢測小鼠血清血小板球蛋白(β-thromboglobulin，β-TG)和P-選擇素含量在小鼠腦缺血再灌注24 h后，眼眶取血，在4 ℃環境下靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，-80 ℃保存待測。隨即采用ELISA法測定，首先向預先包被P-選擇素和β-TG抗體的包被微孔中，分別加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，溫育并徹底洗滌。

1.4免疫組織化學法檢測小鼠缺血腦組織血管性假血友病因子(vonwillebrandfactor，vWF)表達待小鼠腦組織缺血再灌注24 h后，取出小鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)使其麻醉，待小鼠翻正反射消失后，固定在鼠板上，剪開小鼠胸腔使其暴露心臟，確保其心臟保持搏動，先后用事先預冷的生理鹽水和濃度為4%的多聚甲醛灌注，待全身發白身體僵硬后，取腦，依次用4%多聚甲醛和30%蔗糖水溶液固定。然后制備石蠟切片，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素法染色法染色，具體操作步驟按試劑說明書進行。結果分析：每組5只動物，每張切片選取5個高倍視野，顯微鏡下觀察切片vWF表達，采用Image-Pro Plus 6.0專業圖片分析軟件測量免疫陽性產物平均光密度值。

1.5免疫熒光雙標法檢測小鼠缺血腦組織vWF和GPIbα表達組織取材方法同上，待腦組織取出后，取缺血腦半球，進行冰凍切片。每只小鼠取10張制備完成的切片，置于冷丙酮中固定15 min。具體免疫熒光雙染操作按說明書進行。免疫熒光雙染完成后，將制作完成的切片在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片，采用Image-Pro Plus 6.0專業圖片分析軟件分別計算vWF和GPIbα的平均熒光強度。

2 結果

2.1ANF對急性局灶性腦缺血小鼠血清β-TG和可溶性P-選擇素含量的影響與Sham組比較，缺血再灌注24 h后模型組tMCAO小鼠血清中可溶性β-TG和P-選擇素濃度顯著升高(F=10.32、18.79，P<0.01)，同時，相對于模型組，ANF 4 μg/kg和2 μg/kg組tMCAO小鼠血清β-TG和可溶性P-選擇素濃度顯著下降(P<0.01)；而與模型組比較，TRF組tMCAO小鼠血清β-TG和可溶性P-選擇素濃度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1A、1B。

圖1 ANF對急性局灶性腦缺血小鼠血清β-TG和P-選擇素含量的影響

A：β-TG；B:P-選擇素；與Sham組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01

2.2ANF對急性局灶性腦缺血小鼠腦組織vWF表達豐度的影響Sham組小鼠的正常腦組織中vWF表達豐度較低，而模型組tMCAO中小鼠缺血側組織vWF表達豐度較Sham組明顯增高，vWF陽性細胞主要表達在腦組織缺血區域的微血管壁上，切片染色呈棕色顆粒狀。與Sham組比較，模型組tMCAO小鼠缺血側腦組織vWF陽性細胞表達平均光密度明顯升高，差異有統計學意義(F=8.042，P<0.01)。與模型組比較，ANF 4 μg/kg和2 μg/kg組tMCOA小鼠腦組織中vWF表達豐度均有下調，平均光密度值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。TRF組tMCAO小鼠腦組織vWF表達豐度未見降低，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

A：Sham組；B：模型組；C：ANF 4 μg/kg組；D：ANF 2 μg/kg 組；E：ANF 1 μg/kg組；F：TRF組；G：vWF表達豐度；紅色箭頭標示處為vWF陽性顆粒；與Sham組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3ANF對急性局灶性腦缺血小鼠腦血管GPIbα和vWF表達的影響采用免疫熒光雙標法檢測，FITC(fluorescein isothiocyanate)，即異硫氰酸熒光素，其陽性反應在熒光顯微鏡下呈綠色，FITC標記的山羊抗兔二抗與GPIbα反應，顯示GPIbα表達。CY3陽性反應在熒光顯微鏡下呈紅色，CY3標記的山羊抗鼠二抗與vWF反應，顯示vWF表達。將兩者組合(Merged)，在熒光顯微鏡下呈黃色，表示兩者在微血管壁上表達的分布情況。模型組小鼠腦組織GPIba和vWF表清晰達，切片染色主要位于腦組織缺血半球，分別呈綠色和紅色，GPIba和vWF主要表達在腦組織缺血區域的微血管壁上。與Sham組比較，模型組小鼠腦組織vWF和GPIbα的表達豐度明顯升高，差異有統計學意義(F=17.930、5.895，P<0.01)。與模型組比較，ANF 4 μg/kg和2 μg/kg可使tMCAO小鼠缺血側腦組織微血管壁GPIbα和vWF的表達豐度顯著下調，差異有統計學意義(P<0.01)。TRF組雖也可使小鼠腦組織vWF和GPIbα的表達豐度有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的機制還不是很明確，目前公認的引起缺血再灌注損傷的學說有能量代謝障礙、細胞凋亡、氧自由基損傷等[5-6]。腦缺血再灌注損傷是由各種因素共同作用的結果，前期研究[3]證實急性tMCAO小鼠體內凝血系統被激活，血液呈現高凝狀態，缺血側腦組織極易發生二次血栓形成，二次血栓形成后加重腦內循環障礙從而再次損傷腦組織。當腦缺血組織恢復血液灌注時，會造成腦血管內皮細胞的受損，血小板的活化程度會明顯提高，活化血小板與血管內皮、粒細胞相互作用形成血栓，從而造成急性腦梗死，這一系列過程在急性腦梗進程中非常重要。

腦組織血管內皮細胞及活化血小板顆粒釋放大量內容物及膜糖蛋白入血，在組織損傷中是識別血小板活化的重要指標[7]。GPIb是存在于血小板膜上的一種糖蛋白，能夠在血小板活化、血栓形成早期介導血小板黏附、聚集，是vWF和凝血酶受體。胞黏附分子P-選擇素(granular membrane protein 140，GMP140)由血小板α顆粒和內皮細胞釋放，能夠誘導血小板的活化，介導內皮細胞表面上粒細胞和單核細胞的滾動及其與血小板的黏附，GMP140與血栓形成密切相關。β- TG是血小板α顆粒分泌的血小板特異性球蛋白，血小板活化時β- TG被大量釋放進入血液中，其參與凝血、免疫應答反應、炎癥趨化及組織修復等重要生理病理過程，并可進一步加重血管內皮的損傷[8]。研究[9]表明，特定的血小板糖蛋白成分及顆粒釋放物的量的改變不僅僅是血小板活化的標志性指標，而且也是卒中后死亡率的預測因子。加強對血小板活化分子標志物的監測對血管栓塞的預防有著極其重要的作用，同時也為缺血性腦病使用抗血小板藥物進行防治提供了基礎。

圖3 ANF對急性局灶性腦缺血小鼠缺血側腦血管GPIbα和vWF表達的影響 免疫熒光×400

A：腦血管GPIbα平均熒光強度；B：腦血管vWF平均熒光強度；與Sham組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

ANF是九十年代初從蛇毒中分離得到的一種多肽，其相對分子質量為29 799.7，其分子結構相對簡單，包含α、β兩個亞基，是全世界范圍內第一個以GPIb為作用靶點的并在臨床研究中的抗血栓藥物。ANF已在世界上好幾個國家完成臨床試驗，擬用于治療心肌梗死，且具有良好的安全性。前期研究[3]顯示，ANF對缺血再灌注小鼠腦組織具有保護作用，能夠降低腦損傷，改善損傷腦組織功能。 本實驗結果顯示， ANF(4、 2 μg/ kg)可以顯著下調 tMCAO小鼠缺血區過度增高的腦血管 GPIbα和 vWF的表達豐度，降低血循環中血小板活化特異性標志性可溶性 P-選擇素和β-TG的濃度。 進一步分析其機制， ANF作為 GPIb受體拮抗劑，可抑制血小板的過度活化，降低腦血管 GPIbα和 vWF的表達豐度，減少可溶性 P-選擇素和β-TG的過度釋放，進而阻斷 GPIb- vWF途徑，保護內皮血管細胞，防止血栓形成，保持腦微血管的暢通及血液灌注，從而降低缺血再灌注后小鼠的腦損傷，其確切機制有待進一步的研究。