犬牙槽骨干細胞與髂骨骨髓干細胞成骨能力的體內實驗比較研究

顧 曠，周 潔，周 詠，吳 濤，徐孟丹，王默涵，鄭文龍，鄒多宏，王元銀

隨著細胞生物學技術的發展，骨組織工程為骨缺損修復提供了新的方式，并且引起了廣泛的關注[1-2]。獲取并培養能在體內表現出較強成骨能力的干細胞是運用骨組織工程修復骨缺損的主要途徑[3-4]。髂骨來源骨髓間充質干細胞 (iliac bone bone marrow mesenchymal stromal cells，I-BMSC) 具有較強的增殖能力和分化潛能，是目前骨缺損研究中重要干細胞來源之一[5]。除此以外，來自于牙體組織的干細胞也表現出與I-BMSC相似的細胞特性[6-8]。近年來，有研究[9]顯示牙槽骨干細胞 (alveolar bone-derived stem cells，Al-BMSC) 在成骨誘導后，高表達成骨相關基因，為骨組織工程提供一種新的干細胞來源。Al-BMSC相較于其他牙源性干細胞具有諸多優點，取材方便，容易獲得；位置表淺，取材時創傷較小等。基于此，該研究創建拉布拉多犬下頜骨種植體近中臨界骨缺損模型，將Al-BMSC和I-BMSC分別與支架材料復合后，植入種植體近中骨缺損區，觀察二者的成骨能力差異。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 拉布拉多犬10只，36周齡，體重約1.5 kg，購自上海甲干生物實驗動物有限責任公司，飼養于安徽醫科大學實驗動物中心。

1.1.2主要試劑和儀器 高糖DMEM、胎牛血清(美國Gibco公司)；PBS緩沖液(美國Solarbio公司)；胰蛋白酶、戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；β-TCP(上海貝奧路生物材料有限公司)；BLB種植體(北京萊頓生物有限公司)；Bio-Gide(瑞士Geistlich公司)；種植機(奧地利W&H公司)；CO2恒溫恒濕孵育箱(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡、倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1Al-BMSC和I-BMSC的原代獲取與培養 Al-BMSC的培養：使用30 g/L的戊巴比妥溶液靜脈注射麻醉拉布拉多犬6只，麻醉起效后，將拉布拉多犬固定于操作臺，常規備皮、消毒，拔除雙側下頜前磨牙(第一前磨牙、第二前磨牙、第三前磨牙)，從牙槽窩以及其周圍區域使用咬骨鉗獲取牙槽骨的碎片共約3 g左右，放入含有PBS的離心管中，細胞房即刻培養。在超凈工作臺中，使用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗下頜牙槽骨碎片，去除表面口腔唾液的污染。使用無菌器械仔細去除骨塊外側的皮質骨，只保留含有骨小梁的松質骨及包含的血液成分，修剪成2 mm×2 mm大小的碎片，置于含10%FBS的DMEM培養皿中，37 ℃、5% CO2的恒溫恒濕孵育箱中進行培養。5～7 d后進行首次觀察，換液，后每隔3 d細胞換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。I-BMSC的培養：另取2只拉布拉多犬，靜脈注射麻醉，對犬的髂骨進行常規備皮消毒鋪巾，使用骨髓穿刺針內接含肝素鈉注射液的注射器，進行穿刺，抽取骨髓約3 ml注入無菌50 ml離心管，輕輕搖晃均勻，采用全骨髓貼壁法進行細胞培養，5 d后首次換液后每隔3 d細胞換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。當Al-BMSC和I-BMSC細胞生長融合至80%時，使用0.25%胰酶，挑選單個細胞克隆進行傳代，選擇生長狀態良好的第3代細胞進行后續實驗。

1.2.2構建種子細胞與支架材料復合物 高溫高壓消毒108塊直徑5 mm、厚度2 mm的β-TCP材料，浸泡于不含胎牛血清的DMEM中24 h，收集生長狀態良好的第三代Al-BMSC與I-BMSC細胞，稀釋混勻，以1×107個/ml濃度滴加于β-TCP中，在每片材料滴加100 μl細胞懸液，每片材料上的細胞數：1×107個/ml×0.1 ml=1×106個。恒溫恒濕培養箱培養4 h后，加入含10%FBS的DMEM培養基繼續培養，3 d后取部分樣本于電子顯微鏡下觀察材料表面細胞形態。

1.2.3犬下頜骨種植體近中臨界骨缺損模型的建立與修復 拉布拉多犬前磨牙拔除后3個月，可以觀察到拔牙區創口愈合良好，牙槽嵴平坦。使用30 g/L的戊巴比妥溶液靜脈注射麻醉，麻醉起效后，將拉布拉多犬固定于操作臺，常規備皮、消毒、鋪巾。使用直徑5 mm的環鉆在下頜骨缺牙區制備臨界骨缺損模型(5 mm×5 mm×6 mm，近遠中徑×頰舌徑×深度)，每個骨缺損中心間距為12 mm，一側做3個標準的骨缺損。在每個骨缺損區域的遠中進行種植窩洞的預備，按種植鉆頭逐級預備至3.5 mm，植入3枚BLB親水性種植體，直徑4.1 mm，長度10 mm，種植體的一側壁暴露于骨缺損區。在創建的骨缺損區，分別植入β-TCP+Al-BMSC復合物(n=6)，β-TCP+I-BMSC復合物(n=6)和單純β-TCP(n=6)，每個缺損區位點放入3塊細胞材料復合物 (每個缺損位點細胞數：1×106×3=3×106個)。使用Bio-Gide覆蓋骨缺損區，間斷縫合創口。術后，每只實驗動物肌肉注射青霉素(1.5萬IU)2周，每3 d一次。

1.2.4序列熒光標記 術后第4周、第8周、第10周，使用30 g/L的戊巴比妥腹腔麻醉實驗動物，在骨缺損區域分別注射鹽酸四環素(TE,25 mg/kg)、鈣黃綠素(CA,20 mg/kg)茜素紅(AL,30 mg/kg)。

1.2.5組織學分析 術后第12周，處死實驗動物，取拉布拉多犬下頜骨標本，置于5%中性福爾馬林溶液中進行標本固定，梯度脫水，樹脂包埋后，制備硬組織切片。使用激光共聚焦顯微鏡對標本進行熒光標記物的觀察。螯合熒光激發/發射波長分別為405/560～590 nm (TE,黃), 488/500～550 nm (CA,綠), 和 543/580～670 nm (AL,紅)。利用Image-Pro PlusTM圖像分析軟件分析各組術后8周、10周和12周的骨礦化情況。將進行熒光標記物分析的標本使用Van Gieson染色劑進行染色，檢測各組骨形成情況。

2 結果

2.1種子細胞與支架材料復合后的觀察復合物培養3 d后，取部分樣本，清洗，4%多聚甲醛溶液固定，干燥，于掃描電子顯微鏡下觀察細胞生長形態，可見Al-BMSC與I-BMSC在支架材料上較均勻分布，生長狀態良好，見圖1。

圖1 掃描電鏡下β-TCP上細胞生長情況

2.2序列熒光標記物分析激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，β-TCP+I-BMSC組、β-TCP+Al-BMSC 組和單純 β-TCP組的熒光表達量不同：單純 β-TCP組TE (黃色) 的表達量低于β-TCP+I-BMSC組和β-TCP+Al-BMSC 組，CA (綠色) 和AL (紅色) 具有與TE (黃色) 相同的趨勢，見圖2A。使用Image-Pro PlusTM圖像分析軟件分析熒光表達面積并進行統計學處理后顯示：單純 β-TCP 組TE 的熒光表達量(1.32%±0.12%) 低于β-TCP+I-BMSC組 (5.12%±0.93%) 和β-TCP+Al-BMSC組 (9.12%±0.21%),差異有統計學意義 (P<0.05)，β-TCP+Al-BMSC 組的TE表達量高于β-TCP+I-BMSC組，差異有統計學意義(P<0.05)。單純β-TCP 組CA的熒光表達量 (2.51%±0.09%) 低于β-TCP+I-BMSC組 (12.52%±0.95%) 和β-TCP+Al-BMSC組 (12.48%±2.42%)，差異有統計學意義(P<0.05)，β-TCP+I-BMSC組與β-TCP+Al-BMSC組CA表達量之間的差異無統計學意義(P>0.05)。單純β-TCP組AL的熒光表達量 (1.52%±0.08%) 低于β-TCP+I-BMSC組 (2.52%±0.12%) 和β-TCP+Al-BMSC組 (3.43%±0.13%)，差異具有統計學意義 (P<0.05)，β-TCP+I-BMSC組與β-TCP+Al-BMSC組AL表達量之間的差異無統計學意義 (P>0.05)，見圖2B。

圖2 熒光標記組織學分析

A:連續熒光標記后不同時期熒光表達：TE (黃色)，CA (綠色)，AL (紅色) ×63；B:各組熒光表達量的統計學分析；與單純β-TCP組比較：*P<0.05；與β-TCP+I-BMSC組比較：#P<0.05

2.3硬組織切片VanGieson染色組織學分析普通正置顯微鏡下觀察，可見各組骨缺損區域均有新骨形成。β-TCP組骨缺損處新骨形成較少，種植體表面僅有少量的新生骨結合。β-TCP+Al-BMSC組與β-TCP+I-BMSC組中，骨缺損區域有廣泛的新骨形成，且已形成較為成熟的編織骨狀態，種植體表面有大量的新骨結合。統計學結果顯示，β-TCP+Al-BMSC組新骨形成面積為(21.51%±1.61%)，β-TCP+I-BMSC組新骨面積為(29.82%±3.23%)，β-TCP組的新骨形成面積為(9.93%±2.43%)， β-TCP+Al-BMSC組和β-TCP+I-BMSC組的新骨形成面積均高于β-TCP組的新骨形成面積，差異有統計學意義(P<0.05)，而β-TCP+Al-BMSC組與β-TCP+I-BMSC組新骨形成量差異無明顯統計學意義(P>0.05)。 β-TCP+Al-BMSC組種植體周圍骨結合率(0.61±0.07)與β-TCP+I-BMSC組種植體周圍骨結合率 (0.87±0.04)均大于β-TCP組 (0.04±0.01)，差異有統計學意義(F=394.82，P<0.05)，而β-TCP+I-BMSC組骨結合率高于β-TCP+Al-BMSC組，差異具有統計學意義 (P<0.05)，見圖3。

3 討論

牙種植體的植入和穩定依賴足夠的頜骨骨量支持和有效的種植體骨結合。因腫瘤、外傷、牙周病等因素導致的上下頜骨骨組織缺損越來越常見，嚴重影響了牙種植體的有效植入。對于小范圍的骨缺損，通過同期植入顆粒型小牛基質骨，結合骨組織自身的再生能力可在種植體植入的同時實現缺損骨修復。臨界骨缺損，是指無法通過機體自身再生能力進行愈合的缺損，目前廣泛認可的動物模型中骨缺損的臨界尺寸為直徑5 mm[10]。對于治療臨界骨缺損以及超過臨界范圍的嚴重骨缺損，自體骨移植是金標準，但自體骨的獲取常常受到供體區骨量不足、供區二次損傷、手術疼痛增加等限制，因此，骨組織工程為修復較大骨缺損提供了新的治療方式。

骨組織工程主要包括4個要素：種子細胞、生物材料、生長因子和血管化。隨著組織工程學的發展，將種子細胞與支架材料復合后促進骨缺損修復，是骨組織工程學的熱點之一[4]。而種子細胞的選擇直接關系到最終的修復效果。I-BMSC具有較強的細胞增殖能力、優秀的分化潛能，是骨組織工程主要的種子細胞之一。Al-BMSC也具有較強的干細胞增殖分化能力，且取材方便，在拔牙或牙槽嵴修整手術同時即可獲得足夠量的牙槽骨，不會給患者造成二次創傷。大量研究[11]顯示，I-BMSC與Al-BMSC均有較強的成骨分化能力。Lloyd et al[12]將迷你豬Al-BMSC與脛骨來源的BMSC同時使用FGF-2進行誘導培養，結果顯示Al-BMSC的ALP活性高于脛骨來源的BMSC。Matsubara et al[9]利用成骨誘導培養液誘導培養犬Al-BMSC和I-BMSC后，Al-BMSC 組中ALP的活性與鈣離子的含量均與I-BMSC組相近。Pekovits et al[13]將采集到的人Al-BMSC與I-BMSC使用成骨誘導液誘導2周后，Al-BMSC組與I-BMSC組間BGLAP (骨γ羧基谷氨酸蛋白) 與SPARC (富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白) 基因表達水平無明顯差異。

圖3 術后12周Van Gieson染色組織學分析

A：Van Gieson染色后各組骨形成情況；B:統計學分析新骨形成面積；C:種植體周圍骨結合率；與單純β-TCP組比較：*P<0.05；與β-TCP+Al-BMSC組比較：#P<0.05

與上述實驗結果類似，本課題組前期體外實驗[11]顯示，通過成骨誘導液骨向誘導犬Al-BMSC以及I-BMSC，誘導后第7天、第14天以及第21天提取細胞總RNA進行RT-PCR檢測，結果顯示，Al-BMSC組中ALP、COL-I以及OCN的基因表達略高于I-BMSC組，差異具有統計學意義(P<0.05)。但是，Al-BMSC與I-BMSC促進體內缺損骨再生的能力還未見相關報道。基于此，該研究對犬Al-BMSC和I-BMSC促進種植體近中臨界骨缺損修復的能力以及與種植體實現骨結合的能力進行了比較研究。結果表明，犬Al-BMSC與I-BMSC均可促進下頜骨種植體近中臨界骨缺損修復，在新骨形成能力方面，兩者無明顯差別，而I-BMSC可促進更多的骨質與種植體實現骨結合，這種差異可能源自于Al-BMSC的獲取方式與I-BMSC不同。Al-BMSC的獲取主要有兩種方式：骨髓抽吸法和骨塊培養法。骨髓抽吸法：Lloyd et al[12]通過 CT掃描和組織學檢測發現，迷你豬下頜骨正中聯合處近下頜骨下緣1/3處骨組織中含有豐富的松質骨，可使用穿刺針直接抽取獲得下頜骨骨髓血，培養獲得Al-BMSC。 Matsubara et al[9]直接使用穿刺針在比格犬下頜磨牙附近骨組織進行穿刺采集下頜骨骨髓血，培養獲得Al-BMSC。骨塊培養法：Pekovits et al[13]和Akintoye et al[14]將采集到的牙槽骨碎片直接培養在含有培養基的培養皿中，待細胞爬出增殖后傳代。本課題組在獲取犬原代Al-BMSC時，通過穿刺幾乎抽取不到拉布拉多犬下頜骨骨髓血，為了獲得犬Al-BMSC，本研究參考骨塊培養法，用咬骨鉗獲取犬下頜骨磨牙處骨質，去除密致骨，保留松質骨和骨髓血進行體外培養，待細胞爬出結合挑克隆技術對細胞進行純化，盡可能保證所獲取細胞具有干細胞特性，但是難免少量牙槽骨成骨細胞混入，導致骨向分化能力不足，影響其與種植體實現骨結合。