嗎啡后處理對(duì)大鼠離體缺血再灌注心肌自噬的影響

趙其宏, 張 穎, 沙 磊

嗎啡是阿片類鎮(zhèn)疼藥，因其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、價(jià)格便宜，目前仍被廣泛用于臨床。研究[1]表明，嗎啡后處理(postconditioning，PC)可以減輕心肌缺血再灌注損傷(reperfusion injury，RI)，但其機(jī)制尚不明確。自噬可降解長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和受損、衰老的細(xì)胞器，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及修復(fù)細(xì)胞損傷具有重要的生理意義。研究[2-5]表明，自噬在心肌缺血RI中發(fā)揮了重要的作用。然而，嗎啡PC減輕心肌缺血RI的作用是否與自噬相關(guān)，尚未見報(bào)道。該研究旨在探討嗎啡PC對(duì)缺血再灌注心肌自噬的影響及可能機(jī)制，為臨床防治心肌缺血RI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與設(shè)備嗎啡(批號(hào)：150305)購(gòu)自東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司；肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒、HE染色試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein，mTOR)及磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ProteinTech公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購(gòu)自海門碧云天生物技術(shù)研究所；Langendorff灌流裝置、U/4C501H型MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)購(gòu)自南京美易科技有限公司；EPOCH酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2動(dòng)物與分組清潔級(jí)雄性SD大鼠(蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)48只，體質(zhì)量250～300 g，平均分成3組：空白對(duì)照組(C組)，缺血再灌注組(I/R組)，嗎啡PC組(M組)，每組16只。

1.3Langendorff灌流模型的制備大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉充分后斷頭，開胸迅速取出心臟置于改良K-H液[單位(mmol/L)：NaCl 118.5，KCl 4.7，CaCl2·2H2O 2.25，NaHCO324.8，d-葡萄糖 11，MgSO4·7H2O 1.2， KH2PO41.2；pH 7.4]，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管并將心臟固定在Langendorff灌流裝置上，以上述K-H 液常規(guī)恒壓灌流，以95% O2和5% CO2混合氣體飽和K-H 液，維持灌流液溫度37 ℃。C組持續(xù)灌注110 min，其余兩組心臟平衡灌注20 min后，停灌30 min、再灌注60 min，模擬缺血再灌注模型；其中，M組停灌30 min后，于再灌注開始前給予含1 μmol/L嗎啡的K-H液灌注15 s，再換不含嗎啡的K-H 液灌注15 s，重復(fù)4次。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1冠脈流出液CK活性 再灌注末，收集冠脈流出液放入-20 ℃冰箱中保存，待所有標(biāo)本收齊后按照試劑盒說明采用分光光度法測(cè)定CK活性。

1.4.2心肌梗死面積 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將心臟取下，迅速放于-80 ℃冰箱中冰凍20 min，取出后沿心尖向心底部平行切成約2 mm厚的切片5～6片，放入1% 的TTC磷酸鹽緩沖液中(pH 7.4)，37 ℃水浴箱中避光孵育20 min并不時(shí)振蕩，使染色液與心肌切片充分接觸。再用雙蒸水沖洗后放入10%福爾馬林中固定過夜，增加顏色對(duì)比度。將心肌切片拍照后分析，心肌梗死面積百分比(%)=(心肌梗死面積之和/心肌總面積之和)×100%。

1.4.3心肌病理學(xué)觀察 再灌注末，取下心臟并經(jīng)冠狀面剪開，置于10%中性福爾馬林中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4 μm)，貼片，烘烤后制成石蠟切片備用。將上述石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化后，浸入蘇木精染液中染色30～60 s，流水沖洗后1%鹽酸酒精分化1～3 s，雙蒸水沖洗后浸入碳酸鋰中返藍(lán)5～10 s，流水沖洗后放入0.5%伊紅液中染色30～60 s，雙蒸水沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維呈深淺不一的紅色。

1.4.4蛋白表達(dá)情況 再灌注末，剪取左心室前壁心肌組織，沖洗后稱重，放入-80 ℃ 冰箱中保存。所有標(biāo)本取齊后在低溫條件下剪碎、滴加組織裂解液后勻漿、裂解，4 ℃、 12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度后再用裂解液配平，沸水中變性后放入-20 ℃冰箱中待用。裝好玻璃板，按照凝膠配置試劑盒說明書配膠并灌膠，待膠凝固后將夾有SDS-PAGE凝膠的玻璃板轉(zhuǎn)移至電泳槽中，并注入電泳緩沖液，取等量上述蛋白樣品加入上樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳，蛋白分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后放入5% 脫脂奶粉中封閉2 h。PBS沖洗后加入1 ∶1 000的兔抗LC3抗體、mTOR及p-mTOR抗體，4 ℃ 孵育過夜后PBS漂洗，加入1 ∶1 000二抗，室溫孵育 2 h。PBS漂洗后，化學(xué)發(fā)光顯色，條帶掃描后分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1冠脈流出液CK活性與C組比較，I/R組和M組CK活性均顯著增加(P<0.01)。與I/R組比較，M組CK活性顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠冠脈流出液CK活性與心肌梗死面積比較

與C組比較：*P<0.01；與I/R組比較：#P<0.01

2.2心肌梗死面積與C組比較，I/R組和M組心肌梗死面積均顯著增加(P<0.01)。與I/R組比較，M組心肌梗死面積顯著減小(P<0.01)。見表1。

2.3心肌組織病理學(xué)變化C組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維結(jié)構(gòu)完整、清晰，排列規(guī)則有序，無明顯的水腫和壞死。I/R組心肌細(xì)胞水腫明顯，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡樣變性，心肌纖維嚴(yán)重?cái)嗔选⑷芙猓帕形蓙y而稀疏，部分細(xì)胞可見核仁。M組心肌細(xì)胞輕度腫脹、可見少量壞死，心肌纖維斷裂較輕、結(jié)構(gòu)紊亂輕微，大體形態(tài)正常。見圖1。

2.4心肌組織蛋白表達(dá)情況與C組比較，I/R組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著增高(P<0.01)、M組p-mTOR表達(dá)增高(P<0.01)。與I/R組比較，M組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低(P<0.01)、p-mTOR表達(dá)顯著增高(P<0.01)。見表2、圖2。

圖1 3組大鼠心肌組織病理學(xué)變化 HE×200A：C組；B：I/R組；C：M組

表2 3組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR與p-mTOR的表達(dá)水平比較

與C組比較：*P<0.01；與I/R組比較：#P<0.01

圖2 3組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR與p-mTOR的表達(dá)水平

A：LC3-Ⅱ/Ⅰ；B：p-mTOR/mTOR；與C組比較：*P<0.01；與I/R組比較：#P<0.01

3 討論

嗎啡為阿片受體的激動(dòng)劑，阿片受體在體內(nèi)分布廣泛，尤以中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最高。Lu et al[6]研究表明，中樞部位的阿片受體激活后可以減輕在體心臟的缺血RI。因此，為了排除心臟以外因素的干擾，本實(shí)驗(yàn)使用Langendorff離體灌流裝置構(gòu)建大鼠心肌缺血RI模型。此外，參考文獻(xiàn)[1]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇的嗎啡劑量為1 μmol/L；本研究結(jié)果表明，該劑量的嗎啡PC顯著降低離體缺血再灌注大鼠心臟的冠脈流出液CK活性、減小心肌梗死面積、改善組織病理學(xué)變化，與Jang et al[1]的報(bào)道一致。

心肌缺血RI是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象，其機(jī)制十分復(fù)雜。越來越多的研究[2-3]表明，自噬與心肌缺血RI的關(guān)系密切。自噬作為一種程序性死亡方式廣泛存在于真核細(xì)胞中，自噬在平衡細(xì)胞能量、循環(huán)利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞存活方面發(fā)揮著十分重要的作用；然而，過度的自噬會(huì)引起組織損傷[3, 7]。在自噬發(fā)生過程中，胞質(zhì)內(nèi)的I型LC3經(jīng)過泛素樣加工修飾后再與自噬膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合并形成II型LC3；因此，檢測(cè)II、I型LC3的表達(dá)水平，即LC3-Ⅱ/Ⅰ可以反應(yīng)自噬發(fā)生的程度[8]。本研究中，I/R組LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平顯著高于C組，提示缺血再灌注誘導(dǎo)心肌自噬增強(qiáng)；而M組LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平低于I/R組，說明嗎啡PC可以下調(diào)缺血再灌注心肌的自噬水平。本研究結(jié)果顯示自噬發(fā)生的強(qiáng)弱同冠脈流出液CK活性、心肌梗死面積及心肌組織病理學(xué)的變化趨勢(shì)相一致;提示抑制自噬的發(fā)生可以減輕心肌缺血RI，與Zheng et al[3]和張靜 等[4]的研究結(jié)果一致。

自噬發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全弄清，其中mTOR對(duì)自噬的調(diào)控發(fā)揮了重要作用，mTOR磷酸化激活后抑制自噬的發(fā)生[3]。mTOR是眾多信號(hào)分子的靶蛋白，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)就是其中的重要一員。張靜 等[4]研究表明，七氟醚PC通過激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞自噬的增強(qiáng)從而減輕大鼠離體灌注心臟缺血RI。另一項(xiàng)研究[3]顯示，特異性抑制Akt1/2的活性能夠逆轉(zhuǎn)小檗胺PC減輕大鼠離體心臟缺血RI和自噬的作用。而Wu et al[9]報(bào)道，舒芬太尼PC可以上調(diào)缺血RI心肌Akt的磷酸化水平。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是mTOR的另一上游蛋白，ERK激活后通過磷酸化mTOR抑制自噬的發(fā)生而減輕肝臟缺血RI[7]。Ha et al[10]報(bào)道，瑞芬太尼PC能夠上調(diào)缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化表達(dá)水平。此外，阿片類藥物PC還能夠降低缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)[11]，激活一氧化氮合酶[12]，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放[1]，這些都是抑制自噬發(fā)生的可能機(jī)制[13,2]。

綜上所述，嗎啡PC通過抑制自噬的發(fā)生而減輕離體灌注大鼠心臟缺血RI，這一作用可能與其磷酸化激活mTOR有關(guān)。