膜鐵轉運蛋白的缺失對破骨細胞分化的影響

周 劍，王 磊，儲 彬

破骨細胞的骨吸收作用和成骨細胞的骨形成作用在骨骼發育、骨量平衡及骨損傷的修復中至關重要[1]。骨骼通過不斷地骨重建來實現自身的代謝更新，使骨的吸收與形成處于動態平衡。在大多數骨代謝疾病中，如骨質疏松癥、骨Paget's病、牙周病和腫瘤的溶骨性轉移，由于破骨細胞數量的增加或活性的增強導致骨吸收過度表達，進而引起病理性骨流失[2]。鐵是生物體維持穩態的重要元素，哺乳動物的細胞通過攝取轉鐵蛋白、亞鐵血紅素、鐵蛋白或通過非轉鐵蛋白獲得鐵[3]。在哺乳動物細胞中，由Slc40a1基因編碼的膜鐵轉運蛋(ferroportin, Fpn)是目前唯一確定的能夠排出細胞鐵的通道蛋白[4]，未利用的細胞鐵既可以儲存在鐵蛋白中，也可以通過Fpn排出。Slc40a1基因的突變會導致常染色體隱性遺傳性疾病——血色素沉著癥[5]，這是一種鐵超負荷類疾病。近期已有學者研究[6]證明，下調Fpn的mRNA表達水平對破骨細胞有重要的影響，為了進一步探討Fpn在骨髓譜系細胞中的缺失是否影響破骨細胞的分化，該研究建立了基因敲除小鼠模型，在體外觀察Fpn在骨髓譜系細胞中的缺失對破骨細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 本實驗小鼠購自美國Jackson實驗動物中心;α-MEM細胞培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；鼠重組細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)(美國Peprotech公司)；胰酶細胞消化液(美國Life Technologies公司)；10×青霉素-鏈霉素-L-谷氨酰胺、牛血清白蛋白、破骨細胞分化標志物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphase, TRAP)染色試劑盒(美國Sigma公司)；磷酸緩沖鹽溶液(美國Diamedix公司)；RNeasy mini試劑盒(美國Qiagen公司)；High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒(美國Applied Biosystems/Thermo-Fisher Scientific公司)；TaqMan Universal Master Mix(美國Applied Biosystems公司)；RIPA緩沖液、小鼠抗組織蛋白酶K單克隆抗體、小鼠抗α微管蛋白單克隆抗體(美國MilliporeSigma公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物公司)；小鼠抗NFATc1單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗PGC-1β多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.1.2儀器 CO2恒溫細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司)；雙目顯微鏡(美國Olympus公司)；光學顯微鏡(美國Carl Zeiss公司)；Step One Plus熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)；微量紫外分光光度計(美國Thermo scientific公司)；PCR 擴增儀、微孔檢測儀、垂直電泳儀、半干轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1骨髓巨噬細胞及破骨細胞的分離培養 2月齡小鼠用CO2處死后，取雙側股骨及脛骨骨髓，室溫下紅細胞裂解液裂解5 min，在一個100 mm培養皿內接種5×106個骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages, BMMs)，并加入α-10 MEM和M-CSF，于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，隔天換液1次。4～5 d后獲得M-CSF依賴性BMMs。

將兩種小鼠的BMMs接種于多孔細胞培養板中或培養皿內，同時加入含有M-CSF和RANKL(100 ng/ml)的α-10 MEM誘導其向破骨細胞分化，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，于第2天后每天換液1次并收集細胞，即可獲得破骨細胞前體細胞(pre-osteoclasts, pOCs)和成熟的破骨細胞(osteoclasts, OCs)。

1.2.2TRAP染色及陽性細胞計數 如上述細胞培養法，將兩種小鼠的BMMs接種于48孔細胞培養板內(塑料組)及含有骨片的48孔細胞培養板內(骨片組)。塑料組分為兩組(3 d和4 d)，骨片組只有一組(4 d)。每孔細胞密度為1.5×104個/ml，每種細胞設5個副孔。同時加入M-CSF和RANKL誘導分化，于第3天和第4天從細胞培養箱中取出，4%多聚甲醛固定細胞后，TRAP(一種破骨細胞分化標志物)染色：在含有亞硝酸鈉、堿性副品紅溶液及萘酚AS-BI磷酸鹽的NaK酒石酸鹽溶液中36 ℃孵育10～15 min，雙蒸水洗3次后風干，光鏡下觀察。

計數標準：實驗組及對照組2組細胞分別在100倍視野下每孔隨機選取6個視野進行計數。成熟的破骨細胞呈現大圓片狀，粉紅或玫瑰紅色，細胞核≥3個。上述實驗每種細胞6個孔，即重復6次。

1.2.3熒光實時定量PCR 如前所述細胞培養法，將兩種小鼠的BMMs培養于6孔細胞培養板中，分為BMMs組、pOCs組及OCs組，每組6個孔(實驗組3個孔，對照組3個孔)，BMMs組中僅加入M-CSF，而pOCs組及OCs組中加入M-CSF和RANKL誘導其向破骨細胞分化。每孔細胞密度為15×104個/ml。分別于第2天取出BMMs組及pOCs組和第4天取出OCs組，每孔加入350 μl RLT溶液，收集細胞裂解液。使用RNeasy mini試劑盒提取全RNA，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒將全RNA逆轉錄為cDNA。以線粒體基因Mrps2作為內參基因，引物從美國Life Technologies公司購買：Acp5(Mm00475698_m1)，NFATc1(Mm00479445_m1)，Ppargc1b(Mm00504720_m1)，Mrps2(Mm03991065_g1)。通過實時熒光定量PCR檢測其破骨細胞標記基因Acp5(編碼TRAcP)、Nfatc1(編碼破骨細胞關鍵的轉錄因子NFATc1)和Ppargc1b(編碼PGC-1β)中mRNA的表達量。PCR程序參數如下：50 ℃、2 min，95 ℃、 10 min，然后進行40個95 ℃、15 s及60 ℃、18 s的循環。反應完成后進行擴增曲線和熔解曲線分析，基因表達量以檢測基因的初始模板量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4Western blot 如前所述細胞培養法，將兩種小鼠的BMMs培養在100 mm培養皿中，分為BMMs組、pOCs組及OCs組，每組2個培養皿(實驗組1個，對照組1個)，BMMs組中僅加入M-CSF，而pOCs組及OCs組中加入M-CSF和RANKL誘導其向破骨細胞分化。每個培養皿細胞密度為1.5×106個/ml。分別于第2天取出BMMs組及pOCs組和第4天取出OCs組，經RIPA裂解后，搖床上冰鎮30 min，14 000 r/min、4 ℃、離心15 min，提取上清液。再用BCA試劑盒測量蛋白濃度后，按1 ∶4比例加入蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer)，95 ℃煮5 min。SDS-PAGE檢測破骨細胞分化過程中的相關蛋白CTSK、NFATc1和PGC-1β的表達。

2 結果

2.1TRAcP染色

2.1.1在細胞培養板上觀察 對48孔培養板中的細胞分別于第3天和第4天進行細胞固定，然后行TRAcP染色，通過t檢驗結果如下：① 在第3天時，對照組中可見大量TRAP染色陽性的小圓細胞，而成熟的破骨細胞TRAP陽性率為8.76%(73/817)，實驗組已有部分形成大的多核的TRAP染色陽性的成熟破骨細胞，陽性率為43.17%(376/853)，見圖1、表1；② 在第4天時，實驗組已有大量TRAcP染色陽性的多核的成熟破骨細胞形成，陽性率為84.75%(700/830)，而對照組僅有部分破骨細胞形成，陽性率為31.32%(249/783)，見圖1、表1。

2.1.2在骨片上觀察 養在骨片上的細胞在第4天行細胞固定，TRAcP染色后可見實驗組已有大量TRAcP染色陽性的多核的成熟破骨細胞形成，而對照組僅有部分破骨細胞形成，見圖1。

2.1.3細胞計數 顯微鏡下對2.1.1實驗中細胞培養板中的成熟破骨細胞進行計數，如表1及圖2所示，結果如下：① 第3天，實驗組中成熟的破骨細胞數為(376±75)個，對照組為(73±32)個，實驗組明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P=0.000 047 51)；② 在第4天，實驗組中成熟的破骨細胞數為(700±58)個，對照組為(249±22)個，實驗組明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P=0.000 000 96)。

圖1 兩組BMMs分別培養在48孔細胞培養板與骨片上并行TRAP染色 ×1 000

A、B：對照組分別于第3天和第4天在培養板上行TRAcP染色；D、 E：實驗組分別于第3天及第4天在培養板上行TRAcP染色；C、F：對照組與實驗組分別于第4天在骨片上行TRAcP染色

表1 TRAP染色的計數結果

圖2 對TRAP染色陽性的成熟破骨細胞的計數與對照組比較：***P<0.001

2.2實時熒光定量PCRRT-PCR檢測實驗組與對照組中BMMs、pOCs及OCs三組細胞中的破骨細胞標記基因Acp5(編碼TRAP)、Ctsk、NFATc1(編碼破骨細胞關鍵的轉錄因子NFATc1)和Ppargc1b(編碼PGC-1β)的mRNA相對表達量，RT-PCR結果顯示：① 在實驗組及對照組中，隨著破骨細胞分化的逐漸成熟，其相關基因的mRNA表達量逐漸增加；② 在pOCs組及OCs組，實驗組Acp5、Ctsk、NFATc1的mRNA的表達量均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；③ 在OCs組，實驗組Ppargc1b的mRNA表達水平高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)；④ 雖然在pOCs組中，實驗組與對照組之間Ppargc1b的mRNA表達量差異無統計學意義，但實驗組Ppargc1b的mRNA表達水平仍高于對照組，見圖3、表2。

表2 RT-PCR檢測破骨細胞分化過程中標記基因mRMA表達量的P值

2.3Westernblot檢測實驗組與對照組中BMMs組，pOCs組及OCs組三組細胞的CTSK、NFATc1和PGC-1β蛋白表達量，結果如下：① 在BMMs組中，實驗組與對照組的CTSK、NFATc1、PGC-1β蛋白表達量均極低，說明基本上不表達CTSK、NFATc1、PGC-1β蛋白；② 在pOCs組，實驗組三種蛋白的表達量已開始高于對照組；③ 但在OCs組，實驗組中僅NFATc1及PGC-1β的蛋白表達量明顯高于對照組，見圖4。

圖3 RT-PCR檢測破骨細胞標記基因的mRNA的表達水平

A：Acp5(編碼TRAcP)中mRNA的表達水平；B： Ctsk中mRNA的表達水平；C： Ppargc1b(編碼PGC-1β)中mRNA的表達水平；D：Nfatc1(編碼破骨細胞關鍵的轉錄因子NFATc1)中mRNA的表達水平

圖4 通過Western blot檢測破骨細胞分化過程中相關蛋白的表達水平

A: 用tubulin作為內參，檢測CTSK(1 μg/μl)蛋白的表達水平; B: 用tubulin作為內參，檢測NFATc1(1 μg/μl)和PGC-1β(1 μg/μl)蛋白的表達水平; m:巨噬細胞；p:破骨細胞前體細胞；oc:成熟的破骨細胞

3 討論

Fpn也被稱為Slc40a1，在2000年由Donovan et al[7]首先發現，并發表于Nature雜志。目前已經證明Fpn是哺乳動物細胞內排出鐵的唯一通道蛋白[4]，并有大量的研究[8]證明其在鐵代謝平衡中具有重要作用。人的Fpn基因定位在2號染色體上，長度20 bp，并有8個外顯子，其mRNA的5'末端非翻譯區含有一個典型的鐵反應元件IRE[7]。Fpn mRNA編碼的蛋白有570個氨基酸，分子量約62 ku，至少有10個跨膜結構域，是一種膜蛋白。Fpn蛋白在哺乳動物里是一種高度保守的蛋白，人、小鼠、大鼠的序列同源性有 90%～95%[9]。因此，本研究的動物模型選擇小鼠。Fpn蛋白廣泛分布在哺乳動物的十二指腸、胎盤、肝、腎、肌肉、肺、腦等，參與這些器官的鐵代謝[10]。

研究[6]證明，下調Fpn的mRNA表達水平對破骨細胞有重要的影響。但本課題組通過下調多種基因表達并研究顯示，基本都對破骨細胞的分化存在影響[11-12]，故認為這種陽性結果不一定準確。另外，有研究[13]證明，Fpn的種系缺失會導致小鼠胚胎致死。因此，本研究通過在骨髓譜系細胞中特異性敲除Fpn基因，建立了一種全新的基因敲除小鼠模型。取其骨髓巨噬細胞進行細胞培養，并加入RANKL及M-CSF(破骨細胞分化過程中兩種極其重要的細胞因子)誘導其向破骨細胞分化，在顯微鏡下可觀察到Fpn基因敲除的小鼠骨髓巨噬細胞加速形成成熟的破骨細胞，并通過細胞固定，TRAP染色，計數等方法進一步證實了Fpn的缺失對破骨細胞的形成分化有著顯著的促進作用。

為了明確Fpn的缺失在分子水平上如何影響破骨細胞的形成分化，本研究通過熒光實時定量PCR檢測了幾種破骨細胞標志物，結果顯示隨著破骨細胞的形成分化，其標志物顯著增加，其中Acp5、Ctsk、NFATc1這幾種標志物明顯高于陰性對照組，Ppargc1b mRNA的表達量雖然在破骨細胞前體細胞階段升高不具有顯著性，但在成熟破骨細胞階段其表達量顯著增加。這些結果表明Fpn的缺失可能誘導破骨細胞分化形成過程中的多種細胞因子的活化，進而促進骨髓巨噬細胞分化形成成熟的破骨細胞。

本研究又通過Western blot檢測CTSK、NFATc1及PGC-1β的蛋白含量，進一步證實了RT-PCR結果的可靠性。NFATc1和PGC-1β(兩種對破骨細胞分化至關重要的轉錄因子)的蛋白含量隨著破骨細胞的分化逐漸增加，并明顯高于陰性對照組。然而，CTSK似乎在破骨細胞分化成熟階段并沒有顯著升高，這與之前RT-PCR定量Ctsk分析P=0.046相比較，其實并沒有多大矛盾。首先RT-PCR表明Ctsk確實升高，但是相比較其他幾種標志物來說增高并不明顯。其次，破骨細胞在分化形成的過程中，調控的通路并不只有一條，也就是說并不一定每一種標記物都顯著增高，因此本實驗Western blot結果具有可靠性。

綜上所述，本研究揭示了在骨髓譜系細胞中敲除Fpn會促進破骨細胞分化形成。至于其是否會進一步對骨量造成影響，以及對成骨細胞是否有正反饋或負反饋作用，對鐵量的聚集是否有刺激作用，進而引起鐵代謝性疾病，還有待進一步的研究。